真核载体构建.ppt

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1、真核载体构建与表达 2006-6-23载体构建步骤nGet the target DNA sequencenSelect appropriate vectornPCR primer designnObtain cell or tissuenPCR amplification nRestriction,ligation and transformationnScreen positive clonenSequencing获取目的基因序列nhttp:/www.ncbi.nlm.nih.govnhttp:/www.ensembl.org载体的选择n克隆载体nT载体nTopo T载体n普通表达载体克隆

2、载体T载体Topo T载体普通表达载体（plasmid）npCDNA3.1(non fusion or fusion)npCI-HA (fusion with HA tag)npRK5-FLAG(fusion with FLAG tag)npFLAG-CMV(fusion with FLAG tag)npEGFP-C1/N1npIRES2-EGFP引物设计nRestriction sitesnThe same ORF with fusion partnernProtective residuesPCR扩增nDNA polymerasenRich GC sequencenNest PCR限制性内切酶连接nPCR product:vector 10:1nAt 25 C for 2-3 hours or at 16 C overnightnInactive T4 DNA ligase(at 70 C for 10min)转化与鉴定n感受态细胞n酶切鉴定nPCR鉴定n测序抽提质粒与转染细胞n少量与大量制备质粒n选择转染试剂n瞬时转染n稳定转染细胞筛选鉴定nRT-PCRnNorthern BlotnWestern BlotnFunction相关软件n引物设计（primer 5.0、Oligo 6）n序列比较（DNASTAR、Omiga）Thank you!