蛋白真核表达载体的构建方法.docx

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1、蛋白真核表达载体的构建方法实验目的构建真核表达载体，用于蛋白的真核表达。实验原理将克隆基因插入合适的载体后导入到真核细胞中用于表达大量蛋白 质的方法。在蛋白质纯化、定位及功能分析等方面都有应用。实验试剂Tag DNA 聚合酶、DNA Marker DL2000 及 DNA Marker DL15000 (TaKaRa) ； Pfu高保真酶(Stratagene) ； T4 DNA 连接酶、EcoR I、 BanHI和Hind III限制性内切酶(Fermentas) ；E.Z.N.A. Gel Extraction Kit Plasmid Mini Kit (Omega)；抗生素(BBI)；蛋

2、白豚和酵母提取物 (OXOID ) oLB固体培养基(低盐)：在LB液体培养基中加入1.5%琼脂粉，在 121高压下蒸气灭菌20 min。待培养基温度降至50左右，加入相应 的抗生素后，铺制平板，待培养基凝固后，倒放置于4c保存备用。LB液体培养基(低盐)：将胰蛋白陈(Tryptone) 10 g,酵母浸出 物(Yeast Extract) 5 g, NaCl 5 g,溶于适量去离子水中，完全溶解后用 5moi/LNaOH调pH值至7.07.2,定容至1000mL,在121高压下灭菌20 min,室温保存。氨苇青霉素(Ampicillin, Amp)：用灭菌去离子水配成贮存浓度 50 mg/m

3、L, -20 分装备用。感受态细胞制备试剂，0.1 mol/LCaCb溶液：取27 g CaCLFfhO溶于去离子水中并定容至1000 mL,过滤除菌，分装后置-20C保存，用于大 肠杆菌感受态细胞的制备。实验材料InGenius Bio Imaging凝胶成像及分析系统(Gyndene) ；Zentrifugen Rotofix 32离心机(美国Hettich公司产品)；ElixlOO纯净水装置 (Millipore) ； PTC-200型PCR仪(MJReSearch) ； PowerPacTM基石出电 泳仪(BIO-RAD) ； LRH-250n型生化培养箱；Rotina 35R低温水平

4、离 心机(Hettich) ； Model550型酶标仪(BIO-RAD)。操作步骤(一)目的基因扩增Premix Ex Taq上游引物Fl (20处) 下游引物F2 (20|iM) 模版DNA25 pL0.5 |nL0.5 pL2.5(liL21.5|liL50 pL去离子水总体积94预变性4 111皿；94 30 s, 55 30 s, 72 35s ,进行30个循环, 最后72延伸10 min, 4保存。扩增后用1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。(二)PCR产物的回收PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，在长波紫外灯下，用干净刀片 将所需回收的DNA条带切下，尽量切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体

5、 积越小越好；然后使用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物。具体步骤如下: (1)将切下的凝胶放入2 mL离心管，称重记录重量，按照每1g凝胶加入1mL溶胶液对应量，加入适量体积的溶胶液，5065。(：水浴至凝胶完全溶解，每隔23 min振荡一次；(2)把HiBindDNA柱子套在2 mL收集管，加入500g的BL平衡液， 10000 rpm离心 1 min,弃液;(3)将DNA凝胶混合液转移至上述柱子中，10000 rpm离心1 min,倒 去滤液，若混合液多，可分次上柱，每次转移700)iL；(4)加入600 |1L PW漂洗液,10000 rpm离心1 min,倒去滤液；(5)重复上一步；(

6、6)上述柱子，12000 rpm离心空柱2 min,室温静置5 min,是柱子彻 底干燥；(7)把柱子装在干净的1.5 mL离心管上，加入3050|iLddH2。,室温 静置2 min, 12000 rpm离心2 min洗脱出DNA。可重复一次以提高产量。(三)连接克隆载体参照Tarkara公司pMD19-T Vector的使用说明书进行。连接反应体 系(10pL),混匀后，置PCR仪16作用4h以上，-20C保存。载体连接反应体系：总体积10|dL2xLigase Buffer(Ligation Solution I)5 rLPCR纯化产物4.5 |nLpMD19-T Vector0.5 p

7、L(四)连接产物的转化转化用的感受态细胞为大肠杆菌的DH5a菌株，具体步骤如下：(1)取感受态细胞置于冰上，轻弹管壁使其混匀；(2)无菌条件下，5匹连接产物加入到50四融化的感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30 min；(3)混合物于42P水浴锅中热冲击6090 s,不要摇动，迅速移至冰上放置5 min；（4）加入400 rL LB培养基，37。（2振荡培养4560 01后，摇速200rpm；（5）将上述菌液均匀涂在含100阙/mL AMP平板上，待菌液被平板吸 收后（约0.5 h）,做好标记，将平板放在37温箱中倒置培养过夜。（五）摇菌、挑菌转化1216 h后，挑取单克隆，在试管中摇菌58

8、h后，用菌液PCR 法筛选阳性克隆。（1）在每个离心管中加入1.0 mL左右的LB/Amp+液体培养基（无菌操 作）；（2）用镶子夹取小枪头在琼脂培养基上挑选阳性白色菌落，菌落要选 择适当小且圆形的单个菌落；（3）把挑有菌落的枪头放进已加入LB/Amp+培养基的离心管中；（4）挑菌后离心管包紧包好，在37摇床上摇68 h （或者过夜），4 保存。（六）菌液PCR扩增从LB固体培养平皿上挑取单克隆菌落，接入到含AMP的LB液体培养 基中，通过在37的摇床上200rmp过夜培养，利用PCR反应对菌液进行 扩增反应，菌液PCR反应体系（25 rL）如表4：总体积20（liL10.2 pL0.2 |n

9、L0.2 |liL8.4|dLPremix rTaq上游引物Fl下游引物F2菌液去离子水940c预变性4 min； 94 30 s, 55 30 s, 72 35 s,进行30个循环, 最后72延伸10 min, 4保存。扩增后用1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果与预计的目的片段是否一致。(七)阳性菌液测序和序列分析将经鉴定为阳性克隆菌送XX生物科技有限公司测序。(八)摇菌抽质粒参照Omega公司Plasmid Mini Kit产品说明书进行，具体步骤如下：(1)将带有质粒的E.coli接种于5 mL LB/抗生素培养液中，37摇床培养1216h；(2)取1.05.0 mL的菌液,室温下10 OOO

10、xg离心1 min收集细菌;(3)力口入250 uL Solution I/RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全悬浮；(4)往重悬混和液中加入250 uL Solution II,轻轻颠倒混匀4-6次,此操作避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不要超过5 min；(5 )加入350 uL Solution III,温和颠倒数次至形成白色絮4犬沉淀，10000xg 离心 10 min；(6)转移上清液至套有2 mL收集管的HiBind DNA结合柱中，室温下 10000xg离心Imin,倒去收集管中的滤液；(7)把柱子重新装回收集管，加入500 uL HB Buffer,按上述条件离心, 弃去滤液；(

11、8)把柱子重新装回收集管，加入700 uL DNA Wash Buffer,按上述条 件离心，弃去滤液；(9)重复(8)步骤一次；(10)弃去滤液，把柱子重装回收集管，10000义8离心空柱2111吊以甩干 柱子基质；(11)把柱子装在干净的1.5 mL离心管上，加入30-50 uL Elution Buffer(10 mM Tris-HCl, pH8. 5 )或无菌水到柱子基质中，静置l-2min,lOOOOxg离心1 min洗脱出DN A。（九）真核表达载体酶切将提取的质粒与载体分别用相应的酶进行双酶切，在50iL反应体系 加入如下组分（可根据需要量适当调整体系及加入量）：lOxBuffe

12、r5pL载体1fig酶 1 (20 U/L)1|1L酶 2 (20U/pL)1|1L去离子水补全至50 |1L酶切的温度及时间依据酶的不同而变化，常用温度为37C（十）表达载体连接常用的为10 |nL体系，T4 Ligase T4 Ligase Buffer各加1江，目的片 段与载体以nmol比为3/1的比例加入。16。（3连接4h以上，-20C保存。）转化，挑菌，摇菌,液PCR鉴定，抽质粒该部分步骤参照48。（十二）转染：（1）细胞培养：取6孔培养板（或用35 mm培养皿），向每孔中加入2mL含12x105个细胞培养液，37 CCh培养至40%60%（2）转染液制备：在EP管中制备以下两液（

13、为转染每一个孔细胞所用的量）A液：用不含血清培养基稀释1-10 pig DNA,终量100 HLB液：用不含血清培养基稀释2-50解脂质体2000,终量lOOpL 轻轻将A液加至B液中，边加边混匀，室温静置10-15 min。（3）转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血 清培养液。（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37温箱置624h,吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。(也可直接在原来 的培养液中加入血清)(5)转染24 h后可观察荧光，48 h后可裂解细胞进行WB验证。注意事项(1)脂质体转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响；但一些 新型转染试剂不受血清影响。(2)细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞 均可作为受体细胞。