生化蛋白质PPT课件.ppt

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1、1第二章 蛋白质21 1 概述概述3蛋白质的元素组成C：50%-55%H：6%-8%O：20%-23%S：0%-4%N：15%-18%微量元素：P、Fe、Zn、Cu、I 等4 蛋蛋白白质质平平均均含含N N量量为为1616,这这是是凯凯氏氏定氮法定氮法测蛋白质含量的理论依据：测蛋白质含量的理论依据：蛋白质含量蛋白质含蛋白质含量蛋白质含N N量量6.256.255蛋白质的分类按分子外形分纤维状蛋白质球状蛋白质膜蛋白按分子组成分简单蛋白质结合蛋白质：简单蛋白+辅基按功能分酶、调节蛋白、贮存蛋白、转运蛋白、运动蛋白、防御蛋白和毒蛋白、受体蛋白质、支架蛋白、结构蛋白、异常功能。62 2 氨基酸的理化性

2、质氨基酸的理化性质7分子中既有氨基又有羧基的化合物。CCOOHHRNH22.1 氨基酸的结构-氨基酸通式8(1)按R基的化学结构分：脂肪族氨基酸：中性氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；含羟基或硫氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸；酸性氨基酸及其酰胺：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸；芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；杂环族氨基酸：组氨酸、脯氨酸。2.2 氨基酸的分类甘氨酸甘氨酸 （Gly,GGly,G）丙氨酸丙氨酸 （Ala,AAla,A）缬氨酸缬氨酸 （Val,VVal,V）亮氨酸亮氨酸 （Lue,LLue,L）异亮氨酸异亮氨酸 （

3、Ile,IIle,I）中性脂肪族氨基酸含羟基或硫脂肪族氨基酸丝氨酸丝氨酸 （Ser,SSer,S）苏氨酸苏氨酸 （Thr,TThr,T）半胱氨酸半胱氨酸 （Cys,CCys,C）甲硫氨酸甲硫氨酸 （Met,MMet,M）酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸天冬氨酸 （Asp,DAsp,D）谷氨酸谷氨酸 （Glu,EGlu,E）天冬酰胺天冬酰胺 （Asn,NAsn,N）谷氨酰胺谷氨酰胺 （Gln,QGln,Q）赖氨酸赖氨酸 （Lys,KLys,K）精氨酸精氨酸 （Arg,RArg,R）碱性氨基酸芳香族氨基酸苯丙氨酸苯丙氨酸 （Phe,FPhe,F）酪氨酸酪氨酸 （Tyr,YTyr,Y）色氨酸色氨酸 （Trg

4、,WTrg,W）杂环族氨基酸组氨酸组氨酸 （His,H）脯氨酸脯氨酸 （Pro,P）14(2)按R基的极性分：非极性氨基酸：Ala，Ile，Leu，Phe，Met，Trp，Val，Pro 极性氨基酸 无电荷侧链氨基酸：Ser，Thr，Tyr，Asn，Gln，Cys，Gly 带正电荷侧链氨基酸：Lys，Arg，His 带负电荷侧链氨基酸：Asp，Glu152.3 氨基酸的两性解离及等电点氨基酸在水溶液或晶体状态时存在形式R CH COO-NH3+R CH COOH NH2不是两性离子(偶极离子)16 H2N CH COO-H3N+CH COO-RRH+OH-H3N+CH COOHRH+OH-负离

5、子两性离子正离子氨基酸分子在不同pH水溶液中的存在状态：17氨基酸的等电点pI调节氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的NH3+和COO-解离度相等，即氨基酸所带的净电荷为零，在电场中，不向任何一极移动，此时溶液的pH叫做氨基酸的等电点pI。18RH3N+CH COO-H3N+CH COOHRRpH pIpH-折叠-转角无规卷曲；从功能上看正好相反，酶与蛋白质的活性中心通常由无规卷曲充当，-螺旋和-折叠一般只起支持作用。493.4 超二级结构和结构域 超二级结构：由二级结构的基本单位相互聚集，形成有规律的二级结构的聚集体。结构域：多肽链在超二级结构基础上进一步盘旋折叠成的紧密结构。50几种超二级结

6、构51 指含二级结构、超二级结构和结构域的蛋白质，是线性多肽链进一步折叠成为紧密结构时的三维空间排列。概念3.5 蛋白质的三级结构疏水作用力疏水作用力52卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域-螺旋螺旋-转角转角-折叠折叠二硫键二硫键结构域1结构域253肌红蛋白的三级结构54肌红蛋白(myoglobin)分子由一条多肽链(153个残基)和一个血红素组成。分子呈扁圆形，大小为4.5nm3.5nm2.5nm。多肽链主链骨架包含长短不等的A、B、C、D、E、F、G、H 共8个-螺旋。分子中几乎80的氨基酸残基都是位于-螺旋结构中。-螺旋之间的拐弯处(AB、CD、EF、FG、GH)是无规卷曲。绝大多数亲水性

7、R侧链分布在分子的外表面，与水分子结合，使肌红蛋白可溶于水溶液中。绝大多数疏水性R侧链埋藏在分子内部。55分子表面有一个深陷的空穴。该空穴由C、E、F、G 共4个螺旋段构成。空穴周围分布许多疏水性R侧链，从而为洞穴构成了疏水性环境。平面的血红素分子埋人疏水的洞穴中。维持肌红蛋白分子二级结构的力是范德华引力、疏水键、氢键和配位键。56云扁豆蛋白(A)和-乳球蛋白(B)的三级结构图中箭头表示-折叠结构，圆柱体表示-螺旋 573.6 蛋白质的四级结构四级结构：2个或2个以上具有三级结构的亚单位(亚基)，通过非共价键聚合而成的特定的构象以及亚单位的种类和数量。亚基：一般是一条肽链，四级结构必须含有2条

8、或2条以上肽链。58血红蛋白的四级结构59蛋白聚集成四级结构具有下列优势 增强结构稳定性；提高遗传经济性和效率；使催化基团汇集在一起，提高催化效率。寡聚酶具有协同性和别构效应。60过程多肽链二级结构(-螺旋、-折叠、-转角、无规则卷曲等)超二级结构结构域三级结构四级结构61一级结构四级结构二级结构三级结构超二级结构结构域62蛋白质分子内固有的作用力,所产生的分子内相互作用(即范德华相互作用和空间相互作用)；周围溶剂影响所产生的分子内相互作用（包括氢健、静电和疏水相互作用）。3.7 稳定蛋白质空间结构的作用力 63化学键范德华力氢键二、三、四级结构疏水作用次级键共价键 肽键一级结构二硫键盐键三、

9、四级结构二硫键共价键蛋白质分子中的共价键与次级键64蛋白质的空间作用力盐键(离子键）氢键二硫键疏水键氢键氢键疏水键THANK YOUSUCCESS2023/2/865可编辑66（1）空间张力 氨基酸残基的R基侧链的空间位阻限制键的自由旋转。（2）范德华力主要包括偶极-偶极作用力、偶极-诱导偶极相互作用力和色散力。67（3）氢键相互作用肽基团之间的氢键非离子化羧基之间的氢键酚或羟基与肽的羧基之间的氢键侧链酰胺基之间的氢键68（4）静电相互作用是由蛋白质氨基酸中可解离侧链基团引起的，一般蛋白质的静电相互作用能在3.5460KJ/mol范围。（5）疏水相互作用在蛋白质三级结构的形成和稳定中，疏水作用

10、是位于诸多因素的首位。69（6）二硫键限制蛋白质结构的数目维持蛋白质结构的完整性有利于所形成的结构保持稳定。70某些金属(Fe、Ca、Zn、Cu、Mn)可与蛋白质中的基团形成配位键，提高蛋白质的稳定性，并使一些蛋白质具有特殊生物活性。（7）配位键71血红蛋白高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质，是使血液呈红色的蛋白。血红蛋白由四条链组成，两条链和两条链，每一条链有一个包含一个铁原子的环状血红素。氧气结合在铁原子上，被血液运输。72一级结构：蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序和连接方式。二级结构：多肽链主链中各个肽段形成的规则的或无规则的构象。主要有-螺旋、折叠、-转角、无规卷曲。超二级结构：由两个

11、以上二级结构单元相互聚集形成的有规则的二级结构的组合体如、。73结构域：在二级或超二级结构的基础上通过多次折叠，在空间上形成一些半独立的紧密球状结构，叫结构域，它是三级结构的一部分，结构域之间靠无规卷曲连接。一般由100-200个氨基酸残基构成。三级结构：在二级结构基础上，多肽链通过盘旋、折叠，形成紧密的球状构象。亚基或亚单位。四级结构：亚基通过非共价键形成的聚合体的结构。744 蛋白质结构与功能的关系75蛋白质的一级结构决定其高级结构种属差异:在进化过程中，同源蛋白质序列的相似性大小反映蛋白质之间的进化关系的远近。4.1 蛋白质一级结构和功能的关系76细胞色素c的一级结构与生物进化的关系77

12、 患者的Hb量仅为正常人（1516g/100m1）的一半，红细胞不仅数量少而且异常，除有大量的未成熟红细胞外，还有很多长而薄、新月状或镰刀状的红细胞，其携带氧的功能只有正常红细胞的一半。分子病:镰刀形贫血病正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图镰刀形红镰刀形红细胞细胞正常红正常红细胞细胞79 氨基酸序列的细微变化 正常的血红蛋白分子和异常的血红蛋白分子仅在链的第6个氨基酸由谷氨酸Glu变为了缬氨酸Val。-链N端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-GluGlu-Glu-Lys Hb-S（患 者）Val-His-Leu-Thr-

13、Pro-ValVal-Glu-Lys804.2 蛋白质的空间结构与功能的关系别构现象：某些蛋白质表现其生物功能时，构象发生改变，从而改变了整个分子的性质，这种现象称为别构效应。815 5 蛋白质的性质蛋白质的性质82测定方法渗透压法超离心法凝胶过滤法聚丙烯酰胺凝胶电泳法5.1 蛋白质的相对分子质量沉降系数S835.2 蛋白质两性解离性质和等电点pH=pI 净电荷=0 pH pI净电荷为负PrCOOHNH3+H+OH-+H+OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值

14、即为该蛋白质的等电点(pI)。84pI是蛋白质的一个特征常数。蛋白质在等电点时的溶解度最小，因此可以利用蛋白质等电点的不同来沉淀不同的蛋白质，分离蛋白质混合物。855.3 蛋白质的变性概念 由于外界因素的作用，使天然蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化，不包括一不包括一级结构上肽键的断裂。级结构上肽键的断裂。86可逆变性：除去变性因素之后，在适当的条件下蛋白质构象可以由变性态恢复到天然态。不可逆变性：除去变性因素之后，在适当的条件下蛋白质构象由变性态不能恢复到天然态。87物理性质的改变凝集、沉淀流动双折射粘度增加旋光值改变紫外、荧光光谱发生变化化学

15、性质的改变酶水解速度增加分子内部基团暴露生物性能的改变抗原性改变生物功能丧失蛋白质变性现象88引起蛋白质变性的因素物理因素 温度、紫外线、X射线、超声波、高压、表面张力，以及剧烈的振荡、研磨、搅拌等；化学因素 又称变性剂，包括：酸、碱、有机溶剂（如乙醇、丙酮等）、尿素、盐酸胍、重金属盐、三氯醋酸、苦味酸、磷钨酸、去污剂等。895.4 蛋白质的胶体性质由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征。蛋白质溶液稳定的原因：(1)表面形成水化膜；(2)表面带相同电荷。905.5 蛋白质的沉淀反应如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态、失去水化层或消除相同电荷，

16、蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。91(1)盐析法在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，从而使蛋白质颗粒聚集而生成沉淀，这种现象称为盐析。分段盐析：不同蛋白质分子的水膜厚度和带电量不同，发生盐析所需要的盐浓度不同。改变盐浓度可分离蛋白质混合物，这被称为分段盐析法。92(2)有机溶剂沉淀法加入极性的有机溶剂如甲醇等，脱去水化层并增加质点间的相互作用而沉淀。改变有机溶剂的种类和浓度，可分离蛋白质混合物，这被称为有机溶剂分级法。(3)重金属盐沉淀法当pH大于等电点时，蛋白质颗粒带净负电荷，易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。在临床上，利用这种特性抢救重金盐中毒的病人和家畜。93(4)

17、生物碱试剂或酸类沉淀法当pH小于等电点时，蛋白质颗粒带净正电荷，易与生物碱或酸根负离子结合成不溶性盐而沉淀。临床化验时，常用上述生物碱试剂除去血浆中干扰测定的蛋白质。(5)加热变性沉淀法 蛋白质因加热变性而凝固。烹调中蛋白质加热变性，更有助于消化吸收。94长期摄入生鸡蛋可引起生物素缺乏生鸡蛋中含有抗生物素蛋白抗生物素蛋白，且含量高于全蛋生物素含量，抗生物素蛋白可以与生物素牢固结合，使得难以消化，鸡蛋经烹调加热处理后抗生素蛋白即遭破坏。鸡蛋蛋壳表面甚至蛋黄被细菌污染沙门氏菌，引起食物中毒，加热可杀死。955.6 蛋白质的颜色反应反应名称反应名称试剂试剂颜色颜色反应有关基团反应有关基团有此反应的蛋

18、有此反应的蛋白质或氨基酸白质或氨基酸双缩脲反应双缩脲反应NaOH、CuSO4紫红色紫红色二个以上肽键二个以上肽键所有蛋白质所有蛋白质酚酚试剂试剂(福林福林试剂试剂)反反应应磷磷钼酸酸、磷磷钨酸酸蓝色蓝色酚基酚基酪氨酸酪氨酸Tyr乙醛酸反应乙醛酸反应乙醛酸试剂、浓乙醛酸试剂、浓硫酸硫酸紫色紫色吲哚基吲哚基色氨酸色氨酸Trp坂口反应坂口反应次次氯氯酸酸钠钠(次溴次溴酸酸钠钠)、-苯酚苯酚红色红色胍基胍基精氨酸精氨酸Arg米伦反应米伦反应硝酸汞、亚硝酸硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、亚硝汞、硝酸、亚硝酸混合物酸混合物红色红色酚基酚基酪氨酸酪氨酸Tyr966 蛋白质的分离纯化976.1 利用溶解度差别的纯化方

19、法(1)等电点沉淀和pH控制 蛋白质处于等电点时，溶解度最低。在等电点以上或以下的pH时，蛋白质分子携带同种电荷而相互排斥，阻止了分子聚集沉淀，因此溶解度较大。98(2)蛋白质的盐溶和盐析盐溶：在蛋白质水溶液中加少量中性盐，增加分子表面电荷，增强分子与水的作用，使蛋白质在水溶液中的溶解度增大的现象。盐析：在高浓度的盐中，离子将蛋白质水化膜的水夺去，使蛋白质发生沉淀的现象。如饱和硫酸铵。99(3)有机溶剂分级分离法 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因是改变了介质的介电常数。水是高介电常数物质(20时，80)，有机溶剂是低介电常数物质(20时，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4)，因此有机溶剂的加入使

20、水溶液的介电常数降低。100(4)温度 在040之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但人的血红蛋白从025，溶解度随温度上升而降低。在4050以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，在中性pH介质中失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0或更低的温度下进行。1016.2 根据分子大小不同的纯化方法(1)透析和超过滤透析：利用蛋白质分子不能通过半透膜，使蛋白质和其他小分子物质分开的方法。半透膜：玻璃纸、火棉纸和其他改型的纤维素材料。102透析法：利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出

21、，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析。103超过滤：透析时对半透膜加压，一般液体与膜表面相切的方向流动，使部分液体透过膜，另一部分液体切向流过膜表面，将膜截留的蛋白质分子冲走（反流回样品槽），避免在滤膜表面堆积塞。样品含量低时因吸附不能回收而采用此法。104(2)凝胶过滤 又称凝胶过滤层析、分子排阻层析、凝胶渗透层析。这是按大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一。常用的凝胶有交联葡聚糖，聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖等。105小分子进入凝胶分子内，被滞留大分子在凝胶颗粒间移动，较快流出溶剂流动方向溶剂流动方向按分子量从大到小依次流出1066.3 根据电荷不同的纯化方法(1)电

22、泳法 在电场作用下，带电颗粒向与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。相同pH下，分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率不同，在电泳时可以分开。自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。107 纸上电泳：用滤纸作支持物；凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。+-+108109(2)离子交换层析 利用不同的蛋白质分子在溶液中所带电荷不同，因而与离子交换树脂有不同之吸附力，随后改变溶液的pH值或离子强度，结合力最小的蛋白质先洗脱

23、下来。1106.4 根据配体特异性进行分离(1)亲和层析 配基：能被生物大分子识别并与之结合的原子、原子团和分子。利用蛋白质对其配体分子特有的识别能力，即生物学亲和力建立起来的分离纯化方法。凝集素亲和层析、免疫亲和层析、金属螯合层析、染料配体层析和共价层析等都属于亲和层析类 111抗体和抗原的结合：高度特异性把抗体作为“鱼饵”(配体)，分离抗原。112 亲和层析的操作机理固相载体(1)(2)(3)样品洗脱洗脱抗体抗原杂质1136.5 蛋白质分子中氨基酸序列的测定测定蛋白质的分子质量和多肽链的数目拆开蛋白质分子的多肽链断开多肽链内的二硫键分析每一条多肽链的氨基酸组成鉴定多肽链的N末端和C末端残基

24、把多肽链裂解成两组以上大小不等的较小片段测定各肽段的氨基酸序列重叠各肽段，重建完整多肽链的一级结构顺序确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置1147 蛋白质的测定115蛋白质定量法利用蛋白质共性的方法定氮法双缩脲法物理法利用特定氨基酸残基法染料结合法福林酚试剂法116凯氏定氮法原理 消化样品中含氮有机化合物经浓硫酸加消化，硫酸使有机物脱水；同时有机物炭化生成炭；碳将硫酸还原为SO2，C则变为CO2；SO2使氮还原为氨，本身则氧化为SO3；在反应过程中生成的氢，又加速氨的形成；生成物中水和SO2逸去，氨与硫酸结合生硫酸铵留在溶液中。117 硫酸胺在碱性条件下，释放出氨。NH4+OH-加 热 NH3

25、+H2O 吸收与滴定NH3 +H5BO3 NH4+H2BO3-H2BO3-+H+H3BO3蒸馏118仪器凯氏烧瓶定氮球漏斗冷凝管锥形瓶滴定管119试剂及作用浓硫酸：脱水、氧化硫酸铜：催化剂及消化指示剂硫酸钾：提高溶液的沸点氢氧化钠混合指示剂硼酸盐酸120蛋白质计算 V N 0.14 6.25 100蛋白质=WV滴定时所耗盐酸标准溶液的毫升数；N标准盐酸溶液的当量浓度；0.141毫升当量氮的克数；6.25氮的蛋白质换算系数；W样品克数。121注意事项消化时间一般约4小时左右即可，消化时间过长会引起氨的损失。如样品中含赖氨酸或组氨酸较多时，消化时间需延长1-2倍。样品含脂肪或糖较多时，消化时间要长

26、些。同时注意消化过程中产生泡沫溢出瓶外。在蒸馏过程中注意接头处有无松漏现象。122含硝食品中蛋白质的测定以硝酸盐、亚硝酸盐形式存在的氮在凯氏法中消化时将成为硝酸和亚硝酸挥发损失。实验中加入水杨酸使硝态氮变成硝基水杨酸固定下来，加入硫代硫酸钠使其还原为氨基化合物，在浓硫酸作用下分解，最后变成硫酸铵，然后按凯氏法定氮。123 C6H4(OH)COOH+HNO3 C6H3(OH)(NO2)COOH+H2O NaS2O3+H2SO4 H2SO3+S+Na2SO4 C6H3(OH)(NO3)COOH+3H2SO3+H2O C6H3(OH)(NH2)COOH+3H2SO4 C6H3(OH)(NH2)COO

27、H+13H2SO4 NH3+7CO2+13SO2+15H2O 2NH3+H2SO4 (NH4)2SO4124染料结合法方法提要 凡是来源相同的蛋白质，碱性（或酸性）氨基酸的含量，大体上是相同的。利用这个特点，加入过量的酸性（或碱性）染料，使其和蛋白质形成不溶性盐而沉淀析出。用分光光度计测定未反应的染料量，然后根据算出来的结合染料量求出蛋白质含量。125酸性橙12（Acid Orange12)126双缩脲法双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故能呈此反应。127本方法是测定蛋白质浓度常用方法之一。组氨酸以外其他游离的氨基酸、二肽等不显色；除双缩脲、一亚氨基双缩脲、二亚氨基双缩脲、氨醇、氨基酸酰胺、丙二酰胺等少数化合物以外，非蛋白质均不显色、大体上可以看作这是蛋白质所特有的反应。此法灵敏度较差，但操作简便迅速。特点128本章完THANK YOUSUCCESS2023/2/8129可编辑