生化2蛋白质化学.ppt

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1、生化2蛋白质化学 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望学习目的与要求学习目的与要求:1.蛋白质化学的基本组成单位。蛋白质化学的基本组成单位。2.氨基酸的结构、性质及分离测定方法。氨基酸的结构、性质及分离测定方法。3.肽及其结构。肽及其结构。4.蛋白质的结构，性质，功能及分离纯化与测定蛋白质的结构，性质，功能及分离纯化与测定 原理方法。原理方法。重点重点1.1.氨基酸的结构及性质。氨基酸的结构及性质。2.2.蛋白质的结构、性质、功能。蛋白质的结构、性质、功

2、能。3.3.氨基酸及蛋白质的分离测定方法。氨基酸及蛋白质的分离测定方法。难点难点1.1.氨基酸的两性性质。氨基酸的两性性质。2.2.蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定3.3.蛋白质的二级结构的要点蛋白质的二级结构的要点4.4.蛋白质结构与功能的关系。蛋白质结构与功能的关系。1.蛋白质是生物体内的结构高分子蛋白质是生物体内的结构高分子 蛋白质占干重蛋白质占干重 人体中（中年人）人体中（中年人）人体人体 45%水水55%细菌细菌 50%80%蛋白质蛋白质19%真菌真菌 14%52%脂肪脂肪19%酵母菌酵母菌 14%50%糖类糖类1%白地菌白地菌50%无机盐无机盐7%2.蛋白质是一种生物体内的

3、功能高分子蛋白质是一种生物体内的功能高分子 （1）酶的催化作用）酶的催化作用 （2）调节作用）调节作用(多肽类激素多肽类激素)（3）运输功能）运输功能 （4）运动功能）运动功能 （5）免疫保护作用）免疫保护作用(干扰素干扰素)（6）接受、传递信息的受体）接受、传递信息的受体 （7）毒蛋白）毒蛋白 第一节第一节 蛋白质分子组成成分蛋白质分子组成成分一一.元素组成元素组成这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：碳碳 5055 氮氮 1517%铁铁,锌锌,锰锰,钼钼,碘碘,铜等铜等 氢氢 68 硫硫 04 氧氧 2023 磷磷 01%蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有

4、碳、氢、氧外，还有氮和少蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。锌和铜等。其中氮含量较恒定，平均其中氮含量较恒定，平均16%。一克氮。一克氮=6.25克蛋白质。这克蛋白质。这是凯氏定氮法的依据。是凯氏定氮法的依据。二二.蛋白质的水解蛋白质的水解 酸水解：酸水解：蛋白质蛋白质 氨基酸氨基酸 碱水解：碱水解：蛋白质蛋白质 氨基酸氨基酸 酶水解：酶水解：蛋白质蛋白质 氨基酸氨基酸证明：氨基酸是蛋白质的基本组成单位证明：氨基酸是蛋白质的基本组成单位R CH

5、NH3+COO-三三.基本组成单位氨基酸基本组成单位氨基酸（一）氨基酸的结构通式（一）氨基酸的结构通式1.特点特点氨基酸的结构决定了有如下特点：氨基酸的结构决定了有如下特点：具有酸性的羧基和碱性的氨基具有酸性的羧基和碱性的氨基-碳为手性碳原子碳为手性碳原子 由于由于R侧链不同侧链不同或分子型分子型离子型离子型2.非蛋白氨基酸非蛋白氨基酸NH2CH2CHCOOHCH2CH2NH2CONHCH2CHCOOHCH2OHNH2 高丝氨酸：高丝氨酸：-丙氨酸：丙氨酸：-氨基丁酸：氨基丁酸：鸟氨酸：鸟氨酸：瓜氨酸：瓜氨酸：HONCOOHH高半光氨酸：高半光氨酸：HS-CH2-CH2-CH-COOH NH2

6、4-羟脯氨酸：羟脯氨酸：胱氨酸：胱氨酸：H2N-CH-CH2-S-S-CH2-CH-NH2 COOH COOH4-羟赖氨酸：羟赖氨酸：H2N-CH2-CH-CH2-CH2-CH-COOH OH NH2 中性中性AA（15种）种）（1）按）按R基团的酸碱性分类基团的酸碱性分类 酸性酸性AA（Glu，Asp）碱性碱性AA (His,Arg,Lys)（2）按）按R基团的基团的 疏水性疏水性R基团基团AA 极性分类极性分类 不带电荷极性不带电荷极性R基团的基团的AA 亲水性亲水性R基团基团AA 正电荷正电荷 带电荷带电荷R基团的基团的AA 负电荷负电荷 脂肪族脂肪族AA（3）按）按R基团的基团的 芳香

7、族芳香族AA 化学结构分类化学结构分类 杂环族杂环族AA 杂环亚杂环亚AA（二）（二）.氨基酸的分类氨基酸的分类 第二节第二节 氨基酸性质氨基酸性质一、氨基酸的光学活性和光吸收性质一、氨基酸的光学活性和光吸收性质CHOCHOHCH2OHL（-）甘油醛甘油醛L氨基酸氨基酸CHOCHOHCH2OHD（+）甘油醛甘油醛D氨基酸氨基酸n酪氨酸的酪氨酸的 max278nm，278=1.4x103;n苯丙氨酸的苯丙氨酸的 max259nm，259=2.0 x102;n色氨酸的色氨酸的 max279nm，279=5.6x103;氨基酸的光吸收氨基酸的光吸收二二.氨基酸的两性离解性质氨基酸的两性离解性质 氨基

8、酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化子化(-NH(-NH3 3+)形式存在，羧基是以离解状态形式存在，羧基是以离解状态(-COO(-COO-)存在。存在。H3N-CH-COOH R+H3N-CH-COO-R+H2N-CH-COO-R-pK1+H+H+-pK2+H+H+“+”正离子正离子PHPI1.两性离子两性离子 同一分子中既有带正电荷的离子又有带负电荷的离子，同一分子中既有带正电荷的离子又有带负电荷的离子，这种离子

9、称为两性离子。这种离子称为两性离子。2.氨基酸的等电点氨基酸的等电点 在一定的在一定的pH值时，氨基酸分子中氨基的离解度等于羧基的离解值时，氨基酸分子中氨基的离解度等于羧基的离解度时，所含的度时，所含的-NH3+和和-COO-数目正好相等，净电荷为数目正好相等，净电荷为0。在电。在电场中既不向正极移动，也不向负极移动，这一场中既不向正极移动，也不向负极移动，这一pH值即为氨基酸的值即为氨基酸的等电点，简称等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。于两性离子状态。3.氨基酸的等电点的计算氨基酸的等

10、电点的计算H3N-CH-COOH R+H3N-CH-COO-R+H2N-CH-COO-R-pK1+H+H+-pK2+H+H+K1=H3N-CH-COOH R+H3N-CH-COO-R+*H+H2N-CH-COO-RK2=H3N-CH-COO-R+*H+K1*H3N-CH-COOH R+H3N-CH-COO-R+*H+H2N-CH-COO-RK2=H3N-CH-COO-R+*H+*K1*H3N-CH-COOH R+H2N-CH-COO-RK2=H+*2等电点时：等电点时：H3N-CH-COOH R+H2N-CH-COO-R=K1*K2=H+2等式两边取负对数等式两边取负对数-logK1+(-lo

11、gK2)=2(-logH+)pK1+pK2=2pH 侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和和pK2的算术平均值：的算术平均值：pI=(pK1+pK2)/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性值也决定于两性离子两边的离子两边的pK值的算术平均值。值的算术平均值。酸性氨基酸：酸性氨基酸：pI=(Pk-COOH+pKR-COOH)/2 碱性氨基酸：碱性氨基酸：pI=(pK-NH2+pKR-NH2)/2 pH PI溶液对溶液对PI而言偏碱而言偏碱 带带+PI与与PH的关系的关系 p

12、H=PI溶液对溶液对PI而言中性而言中性 不带电不带电 pH PI溶液对溶液对PI而言偏酸而言偏酸 带带-等电点等于酸性基团离解常数与碱性基团离解常数之和的一半等电点等于酸性基团离解常数与碱性基团离解常数之和的一半或等电点等于两性离子两侧离解基团离解常数之和的一半或等电点等于两性离子两侧离解基团离解常数之和的一半Lys的解离如下：的解离如下：KCOOHK-K-H+H+H+（+）（+）（）（-）Asp解离如下解离如下:K-COOHK-COOHK-H+H+H+-COOH（+）（-）（-）（）4.根据滴定曲线求根据滴定曲线求pK6.022.349.69丙氨酸的滴定曲线丙氨酸的滴定曲线三三.氨基酸的化

13、学反应氨基酸的化学反应1.与甲醛反应与甲醛反应（一）（一）.氨基参与的反应氨基参与的反应2.与亚硝酸反应与亚硝酸反应R CHNH3+COO-R CHON2CO2HNO2+此反应是此反应是Vanslyke定氮的原理定氮的原理3.与与2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB）反应）反应4.与异硫氰酸苯酯（与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应）的反应NHS:CCHCOR1HNNHCHCOR2+5.5.与丹磺酰氯反应与丹磺酰氯反应与丹磺酰氯反应与丹磺酰氯反应:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与以与N-N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰端氨基酸的

14、游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。氨基酸。此法的优点是丹磺酰此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到灵敏度可以达到1 1 1010-9-9molmol。（二）（二）.羧基参与的反应羧基参与的反应肼解反应肼解反应肼解反应肼解反应 此法是多肽链法是多肽链C-C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-C-

15、端氨基酸分离端氨基酸分离。（三）（三）.氨基和羧基共同参与的反应氨基和羧基共同参与的反应茚三酮反应茚三酮反应00000H00HH2O00H0HH2N-CH-COOHRNH3+RCHO+CO200H00H00H0H+NH3+00H00H0=N0O-O蓝紫色化合物蓝紫色化合物入入max=570nm脯氨酸，羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质脯氨酸，羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质入入max=440nm00H00HCCCO-ON+CO2HNCOOH反应名称反应名称反应试剂反应试剂反应基团反应基团颜色颜色用途用途黄色反应黄色反应浓硫酸浓硫酸+浓硝酸浓硝酸苯基、酚基苯基、酚基黄色黄色Phe Tyr米伦反应米

16、伦反应硝酸汞（亚汞）硝酸汞（亚汞）酚基酚基红色红色 Tyr乙醛酸反应乙醛酸反应乙醛酸乙醛酸吲哚基吲哚基紫红紫红Trp坂口反应坂口反应萘酚萘酚+NaClO胍基胍基红色红色Arg福林酚反应福林酚反应磷钼酸磷钼酸+磷钨酸磷钨酸酚基、吲哚基酚基、吲哚基蓝色蓝色Trp TyrPauly反应反应重氮盐重氮盐咪唑基咪唑基酚基酚基棕红色棕红色桔黄色桔黄色His Tyr巯基反应巯基反应亚硝酸亚铁氰酸亚硝酸亚铁氰酸钠钠巯基巯基红色红色Cys（四）（四）R-侧链反应侧链反应-呈色反应呈色反应第三节第三节.氨基酸的分离与测定氨基酸的分离与测定一一.层析法层析法二二.电泳法电泳法三三.氨基酸的测定氨基酸的测定第四节第四

17、节 肽肽一一.肽的结构肽的结构氨基酸残基氨基酸残基肽单位肽单位二二.生物活性肽生物活性肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-Met-脑啡肽脑啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-脑啡肽脑啡肽H2N-CHCH2CH2-CO-NH-CH-CO-NH-CH2COOH COOH CH2 SH2GSH GS-SG1.谷胱甘肽谷胱甘肽2.脑啡肽脑啡肽 Leu-(D)phe-pro-val-OrnOrn-val-pro-(D)phe-Leu4.短杆菌肽短杆菌肽S（Orn鸟氨酸）鸟氨酸）3.催产素催产素第五节第五节 蛋白质分类蛋白质分类一一.根据蛋白质分子

18、形状分类根据蛋白质分子形状分类1.球状蛋白球状蛋白2.纤维状蛋白纤维状蛋白二二.根据蛋白质的组成成份分类根据蛋白质的组成成份分类1.单纯蛋白单纯蛋白 2.结合蛋白结合蛋白 清蛋白清蛋白 核蛋白核蛋白 谷蛋白和醇溶谷蛋白谷蛋白和醇溶谷蛋白 色蛋白色蛋白 精蛋白和组蛋白精蛋白和组蛋白 糖蛋白糖蛋白 硬蛋白硬蛋白 脂蛋白脂蛋白 磷蛋白磷蛋白第六节第六节 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构一一.蛋白质的氨基酸组成蛋白质的氨基酸组成1.蛋白质的氨基酸组成可用残基重量百分数表示蛋白质的氨基酸组成可用残基重量百分数表示147165如：如：100克胰岛素克胰岛素 分析得到分析得到 phe8.6克，其重量百分数为

19、：克，其重量百分数为：残基分子量残基分子量氨基酸含量氨基酸含量*=8.6*=7.7克氨基酸分子量氨基酸分子量2.根据百分组成计算氨基酸的分子个数根据百分组成计算氨基酸的分子个数如：胰岛素分子量为如：胰岛素分子量为6000，丙氨酸占，丙氨酸占4.6%，氨基酸个数为：，氨基酸个数为：=34.6%*6000 89氨基酸的百分含量氨基酸的百分含量*蛋白质分子量蛋白质分子量氨基酸的分子量氨基酸的分子量 a盐键（离子键）b氢键 c疏水相互作用力 d 范德华力 e二硫键 f 酯键二二.蛋白质分子结构中的化学键蛋白质分子结构中的化学键维系蛋白质分子的一级结构：肽键维系蛋白质分子的一级结构：肽键维系蛋白质分子的

20、二级结构：氢键维系蛋白质分子的二级结构：氢键维系蛋白质分子的三级结构：疏水相维系蛋白质分子的三级结构：疏水相 互作用力互作用力维系蛋白质分子的四级结构：范德华维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键、氢键、疏水相互作用力力、盐键、氢键、疏水相互作用力离子键离子键氢键氢键范德华力范德华力疏水相互作用力疏水相互作用力氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键氢键、范德华力虽然键能小，但数量大氢键、范德华力虽然键能小，但数量大疏水相互作用力对维持三级结构特别重要疏水相互作用力对维持三级结构特别重要盐键数量小盐键数量小二硫键对稳定蛋白质构象很重要，

21、二硫键越多，蛋白质分子构象越二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定稳定三三.蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定（一）氨基酸组成成分分析（一）氨基酸组成成分分析（二）末端分析（二）末端分析 1.N-末端末端 2.C-末端末端（三）肽链伸展与分离（三）肽链伸展与分离（四）肽链部分水解与肽段分离（四）肽链部分水解与肽段分离（五）肽段的氨基酸顺序测定（五）肽段的氨基酸顺序测定（六）由各段顺序推断的氨基酸顺序（六）由各段顺序推断的氨基酸顺序化学法：化学法：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。酶

22、法酶法 -HN-CH-CO-NH-CH-CO R1 R2胰酶：胰酶：R1=Lys.Arg胰凝乳酶：胰凝乳酶：R1=phe.Tyr.Trp胃酶：胃酶：R1 R2=phe.Tyr.Trp.leu嗜热菌蛋白酶：嗜热菌蛋白酶：R2=phe.Tyr.Trp.leu.Ile.valGlu酶：酶：R1=Glu.AspArg酶：酶：R1=Arg第七节第七节 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构二级结构二级结构超二级结构超二级结构结构域结构域三级结构三级结构四级结构四级结构高级结构高级结构-螺旋螺旋-折叠折叠-转角转角自由回折自由回折高级结构的概念：高级结构的概念：1.-螺旋螺旋一一.二级结构二级结构要点：要点：螺

23、旋的角度与高度螺旋的角度与高度维持螺旋的作用力维持螺旋的作用力影响螺旋稳定的因素影响螺旋稳定的因素螺旋的种类螺旋的种类2.-折叠折叠要点：要点：肽链的走向（种类）肽链的走向（种类）残基轴心距离残基轴心距离维持的作用力维持的作用力影响螺旋稳定的因素影响螺旋稳定的因素3.-转角转角4.自由回折自由回折氢键氢键1800的回转的回转 二二.超二级结构超二级结构 三三.三级结构三级结构要点：要点：形状形状折叠折叠作用力作用力四四.四级结构四级结构一级结构一级结构二级结构二级结构超二级结构超二级结构结构域结构域三级结构三级结构亚基亚基四级结构四级结构第八节第八节 蛋白质分子结构与功能蛋白质分子结构与功能一

24、一.一级结构与功能的关系一级结构与功能的关系1.胰岛素的结构与功能胰岛素的结构与功能2.血红蛋白结构与功能血红蛋白结构与功能3.细胞色素细胞色素C与生物进化与生物进化二二.蛋白质的构象与功能的关系蛋白质的构象与功能的关系三三.个别蛋白质结构与功能个别蛋白质结构与功能1.纤维状蛋白纤维状蛋白角蛋白角蛋白2.丝心蛋白丝心蛋白第九节第九节 蛋白质的性质蛋白质的性质一一.蛋白质的分子大小蛋白质的分子大小1.根据化学成分测定最小相对分子质量根据化学成分测定最小相对分子质量据其百分含量可计算出最低相对分子质量：据其百分含量可计算出最低相对分子质量：最小相对分子质量最小相对分子质量（成分的相对分子或原子质量

25、）（成分的相对分子或原子质量）已知成分的百分含量已知成分的百分含量2.沉降系数沉降系数一个一个S单位，为单位，为110-13秒秒蛋白质的沉降系数：蛋白质的沉降系数：1200S，相对分子质量越大，相对分子质量越大，S值越大值越大 由沉降系数由沉降系数S可根据斯维得贝格可根据斯维得贝格Svedberg方程计算蛋方程计算蛋白质分子的相对分子质量：白质分子的相对分子质量：M=RST/D1i R：气体常数：气体常数 T：绝对温度：绝对温度 D：扩散系数：扩散系数 ：溶剂的密度：溶剂的密度S=dx/dt2x 蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有

26、等电点。在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在不同的在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白

27、质溶液具有胶体由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。分子杂质除去。二二.蛋白质的两性离解和电泳现象蛋白质的两性离解和电泳现象三三.蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质四四.蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关

28、。所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。蛋白质的性质与它们的结构密切蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性丧失。这种现象称为蛋白质的变性.五五五五.蛋白质的变性蛋白质的变性蛋白质的变性蛋白质的变性 大部分蛋白质均含有带大部分蛋白质均含有带芳香环的苯

29、丙氨酸、酪氨酸芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的和色氨酸。这三种氨基酸的在在280nm 附近有最大吸收。附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。质进行定性鉴定。六六六六.蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收 蛋白质在等电点蛋白质在等电点pH条件下，不发条件下，不发生电泳现象。利生电泳现象。利用蛋白质的电泳用蛋白质的电泳现象，可以将蛋现象，可以将蛋白质进行分离纯白质进行分离纯化化。第十节第十节 蛋白质分离纯化及测定蛋白质分离纯化

30、及测定一一.蛋白质分离纯化的方法蛋白质分离纯化的方法根据分子大小根据分子大小根据溶解性根据溶解性根据电荷根据电荷根据吸附力根据吸附力根据特异性亲和力根据特异性亲和力透析透析/超过滤法超过滤法密度梯度离心法密度梯度离心法凝胶过滤法凝胶过滤法PI沉淀法沉淀法盐溶和盐析法盐溶和盐析法电泳法电泳法离子交换法离子交换法凝胶过滤法凝胶过滤法凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外洗脱时大分

31、子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大下来，洗脱体积大测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex二二.蛋白质浓度测定的方法蛋白质浓度测定的方法1.福林试剂反应福林试剂反应福林试剂：磷钼酸福林试剂：磷钼酸-磷钨酸将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨磷钨酸将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨 蓝混合物。酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应）蓝混合物。酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应）2.双缩脲法双缩脲法在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应 蛋白质蛋白质-铜络合物，铜络合物，灵敏度提高灵敏度提高100倍倍3.考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色，与蛋白的亲和力强，灵敏度高，本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色，与蛋白的亲和力强，灵敏度高，1-1000微克微克/毫升毫升4.凯氏定氮法凯氏定氮法5.紫外吸收法紫外吸收法