DNA测序与基因芯片.pdf

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1、 DNA 测序与基因芯片 一、背景介绍 20 世纪 70 年代，弗雷德桑格尔（Frederick Sanger）发明基因测序技术，并因此获得诺贝尔奖。1990 年 10 月，在全球范围内引起巨大反响的“人类基因组计划”（Human genome project,HGP）正式启动，至 2003 年，中、美、日、德、法、英等 6 国科学家联合宣布人类基因组序列图绘制成功，历时 13 年，耗资额近 30 亿美元。基因组计划是人类为了探索自身奥秘所迈出的重要一步，是继曼哈顿计划和阿波罗登月计划之后，人类科学史上的又一伟大工程。就像了解人类身体构造对于目前医学发展的贡献，对人类基因组的了解对医学和其他健

2、康科学提供必不可少的支持，可以达到从根本上认识生命的起源、种间、个体间的差异的原因，疾病产生的机制，以及长寿、衰老等困扰着人类的最基本的生命现象。此后，基因测序技术突飞猛进，测序时间明显缩短，且成本也有大幅下降。但是，随着越来越多的基因组序列得以测定，基因序列数据也正以前所未有的速度迅速增长。建立一种方法去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能，就大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要，而基因芯片的出现为解决此类问题提供了光辉的前景。基因测序和基因芯片是两种重要的基因组学研究方法，是解开包括癌症在内的很多疾病与基因之间紧密联系必不可少的工具，在生命科学研究领域有着极其广泛的应

3、用前景 二、主要技术路线 1.基因测序 测序技术最早可以追溯到 20 世纪 50 年代，早在 1954 年就已经出现了关于早期测序技术的报导，即 Whitfeld 等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列。直至 1977 年 Sanger 等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和 Gilbert 等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。此后三十几年的发展中陆续产生了第二代测序技术，这些技术都采用了合成测序法，只是在 DNA 阵列的排布、DNA簇扩增，以及基于酶的测序生化反应方面存在差异。最近，Helicos 公司的单分子测序技术和 Oxford Nanopare Technologies 公司

4、正在研究的纳米孔单分子测序技术被认为是第三代测序技术。测序技术正向着高通量、低成本、长读取长度的方向发展。（1）（2）第一代测序技术 Sanger 测序法，又称末端终止法测序技术，其基本原理是利用一种 DNA 聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个独立的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP），并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。由于 ddNTP缺乏延伸所需要的 3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性的在四种脱氧核苷酸三磷酸（G、A、T 或 C）处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种 dNTP

5、s和 ddNTPs 的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几至几千碱基的链终止物。它们有共同的起点，但是终止在不同的核苷酸上，因此长度各有不同，通过凝胶电泳将这些 DNA 片段进行分离，同时借助自显影、非同位素标记或其它方法等进行检测。Sanger 测序法经历了从最初的手工测序到半自动化、全自动化的发展。目前，最先进的一代测序设备是 Applied Biosystem 3730XL 测序仪。它采用毛细管电泳代替平板电泳分离技术，可以提供高质量、高通量的片段读取和序列分析，应用灵活而广泛，同时可分析 96 或 384 个样品，不间断 24 小时运行，自动灌胶、上样、电泳分离、检测及数据分析。如今，

6、测定每千个碱基序列的成本是美元，每天的数据通量可以达到 600000 个碱基，原始数据的准确率可以高达%。然而，由于其对电泳分离技术的依赖，第一代测序技术在速度和成本方面都已达到了极限，使其很难有进一步提升分析速度和提高并行化程度的空间，并且很难通过微型化降低测序成本。因此，需要开发全新的技术来突破这些局限。尽管如此，第一代测序技术不会很快消失，它将于新的若干测序平台并存。其久经考验的方法可靠、准确，且已形成规模化，特别是在 PCR 产物测序、质粒和细菌人工染色体的末端测序、以及 STR 基因分型方面，将继续发挥重要作用。（3）第二代测序技术 第二代测序技术作为对传统测序一次革命性的改变，是最

7、近几年建立的高通量技术，其特点是一次测序反应可以产生千万到亿万条序列，而测序的成本大大降低，因此又称下一次测序技术（Next Generation Sequence，NGS）。所有下一代测序平台的核心思想都是边合成边测序（Sequencing by Synthesis），即通过捕捉新合成的末端的标记来确定 DNA 序列。目前为止，3 种广泛使用的商业化平台技术是 Roche 公司的 454 FLX 技术、Illumina 公司的 Solexa 技术和 ABI公司的 SOLiD 技术。它们基本都是在 20 世纪 90 年代末被发明和开发出来，在2005 年前后商业化，通过几年的发展，每种平台都有

8、不同程度的升级。这三个 技术平台各有优点，454 FLX 的测序片段比较长，高质量的读长能达到 400bp；Solexa 测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有 454 测序的 1/10；SOLiD 测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于%，而在 15X 覆盖率时的准确度可以达到%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。但是，所有的这些平台都遵循了类似的工作流程，尽管从模板文库制备、片段扩增到测序，这些方法所采用的技术与生物化学相当多样，但是都采用了大规模矩阵结构的微阵列分析技术，阵列上的 DNA 样本可以被同时并行分析。首先，构建 DNA

9、 模板库。通过随机打断基因组 DNA 获得长度为数十到数百碱基的的 DNA 文库片段，或者构建控制距离分布的配对末端片段。接着，在双链片段的两端连上接头序列，然后变性得到单链模板文库，并固定在固体表面上，固体表面可以是平面或是微球的表面。克隆的扩增通过以下几种方式之一进行，如桥式 PCR、微乳滴 PCR 或原位成簇。随后，对在芯片上的 DNA 簇或扩增微球，利用聚合酶或者连接酶进行一系列循环的反应操作，通过显微检测系统监控每个循环生化反应中产生的光学事件，用 CCD 相机将图像采集并记录下来，对产生的阵列图像进行时序分析，获得 DNA 片段的序列。最后，按照一定的计算机方法将这些片段组装成更长

10、的重叠群。在一般性描述中，下一代测序技术的特点显而易见：第一，通过有序或者无序的阵列配置可以实现大规模的并行化，以提供高程度的信息密度。不同的测序平台一次实验可以读取 40 万到 400 万条序列，读取长度从 25bp 到 450bp，读取的碱基数从 1G到14G 不等，这样庞大的测序能力是传统测序仪所不能比拟的。第二，不采用电泳，设备易于微型化。相对于第一代测序技术，第二代测序的样本和试剂消耗量得以降低，但是第二代测序仪的推广可能因为其价格昂贵有些困难，只有当实验室的测序工作量非常大时才会考虑购买。目前，一些模式生物的全基因组测序、非模式生物的全基因组测序以及一些生物的转录组测序都采用了第二

11、代测序技术。（4）第三代测序技术 尽管第二代测序技术已显示出巨大的潜力，但是因为科学的不断进步，在给测序技术提出新的要求时，也给这项技术带来了新的增长点。2008 年 4 月 Helico BioScience 公司的 Timothy 等人在 Science 上报道了他们开发的真正的单分子测序技术，也被成为第三代测序技术。这项技术完全跨过了第二代测序技术依赖基于 PCR 扩增的信号放大过程，真正达到了读取单个荧光分子的能力，向 100美元测定一个人类基因组的目标迈进了一大步。第三代测序技术实现了 DNA 聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测 10 个碱基，测序速度是化学法测序的 2 万倍；它还

12、实现了 DNA 酶内在的延续性，一次反应就可以测长达几千个碱基的序列，这为基因组的重复序列的拼接提供了非常好的条件；而其还有两个应用是第二代测序所不具备的，即可以直接测 RNA 的序列和可以直接测甲基化的 DNA 序列。；目前来看，这种第三代测序仪将主要用于使用第一和第二代测序仪无法解决的人类基因组片段的测序以及表观遗传学研究领域。在不远的将来，如果他们能和二代测序一样集成 100 万个纳米微孔，那么一台仪器 15 分钟就能够准确地测出一个人的基因组。2.基因芯片 基因芯片（Gene Chip）的原型是 80 年代中期提出的，系指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测

13、每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。它将生命科学研究中所涉及的不连续的分析过程(如样品制备、化学反应和分析检测)，利用微电子、微机械、化学、物理技术、计算机技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，使之连续化、集成化、微型化。该技术的发展直接得益于探针固相原位合成技术和照相平板印刷技术的有机结合以及激光共聚焦显微技术的引入，它使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子切实可行，而且可以对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测和分析，因此又称 DNA 微阵列（DNA Microarray）。基因芯片技术主要包括四个基本要点：芯片方阵的构建、样品的制备、生物分子反应和信号的检

14、测。目前 DNA 探针列阵的构建方法主要有两种策略：即直接在芯片上进行的寡聚核苷酸探针原位合成（In Situ Synthesis）和芯片外（Off-chip）的探针合成两种方法，通过这些方法可以将寡聚核苷酸或短肽固定到诸如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等经过特殊处理的固相支持物上。然后将待测样品用荧光或其它方法标记后作为靶分子与基因芯片上的探针阵列杂交，由于在基因芯片阵列中某一特定位置上的核苷酸序列是已知的，所以对微阵列每一位点的信号进行检测，即可对样品的遗传信息进行定性定量分析。而检测和分析测定方法主要为荧光法，其重复性好，不足之处是灵敏度仍较低。同时，质谱法、化学发光法、光

15、导纤维法也正在逐步发展。罗氏（Roche）、安捷伦（Agilent）、昂飞（Affymetrix）、Illumina 等多家公司都针对不同的研究需求推出了多种芯片，包括了表达谱芯片、SNP 芯片、比较基因组杂交（CGH）芯片、microRNA 芯片、DNA 甲基化芯片、染色质免疫共沉 淀（Chip-on-chip）芯片等各种基因芯片产品。1998 年底美国科学促进会将基因芯片技术列为年度自然科学领域十大进展之一，足见其在科学史上的意义。在实际应用方面，基因芯片这一时代的宠儿已被应用到生物科学众多的领域之中，包括疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防、

16、航天等许多领域。它将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径，为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。在疾病诊断方面，与传统的检测方法相比，它可以在一张芯片上，同时对多个病人进行多种疾病的检测，还可以从分子水平上了解疾病，使医务人员能在短时间内掌握大量的疾病诊断信息，找到正确的治疗措施，指导临床用药。三、应用领域 将测序技术与生物芯片技术相结合，使其成为广泛使用的常规实验手段，可以协助广大科研工作者以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质组的各项数据，快速和准确地获取生物体的遗传信息，

17、这对于生命科学的研究具有十分重要的意义。1.疾病研究与诊断）大多数人类常见疾病，如糖尿病、高血压、冠心病、银屑病、精神分裂症、阿兹海默症等，因具有患病率高，发病机理复杂，难以治愈等特点，也只是困扰医学界的难题。这些疾病都是由多个微效基因的累加效应结合环境因素共同作用所导致，也被成为多基因遗传病。对于这类疾病的研究主要集中在寻找和定位疾病易感基因方面。例如，利用全基因组关联分析（Genome-Wide Association Studies,，GWAS），通过分析标签单核甘酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs）检测人类基因组中大多数常见的 SNPs，

18、识别人类基因组中可能与复杂疾病相关联的变异。这种方法最近几年在人类医学领域中发展迅速，在过去五年中，研究人员利用 GWAS 对 100 多种复杂疾病和性状进行了研究，发现了大批易感基因和位点。此外，利用基因芯片技术还可以对疾病做出快速、简便、高效、准确地分析而得出病变信息：DNA 突变发生在什么位点属于什么类型的序列突变基因表达是否有异常得出正确的诊断之后，即可根据病变的靶序列或靶蛋白设计相应的药物，以改变靶序列的表达情况从而达到治疗疾病的目的。目前基因芯片在感染性疾病、遗传性疾病、重症传染病和恶性肿瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势。与传统检测方法相比，它可以在一张芯片同时对多个病人进行多

19、种疾病的检测，无需机体免疫应答反应期，能及早诊断，待测样品用量小；能特异性检测病原微生 物的亚型及变异；可帮助医生及患者从“系统、血管、组织和细胞层次（通常称之为第二阶段医学）”转变到“DNA、RNA、蛋白质及其相互作用层次（第三阶段医学）”上了解疾病的发生、发展过程，这些特点使得医务人员在短时间内 可以掌握大量的疾病诊断信息，这些信息有助于医生在短时间内找到正确的治疗措施。例如，在人类所患肿瘤中，有 50%以上都是由 P53 基因突变所致，目前 Affymetric 公司已研制出 P53 基因芯片，用于肿瘤的早期诊断及肿瘤易感性的判断。此外，尚有检验 HIV 的芯片及有无药物代谢缺乏症的 C

20、ytP450 芯片等。2.药物筛选 同一物种不同种群和个体之间，有许多不同的基因型，这种不同与个体的不同性状、多种遗传病都有着密切的关系。通过对大量具有不同性状的个人基因型进行比较，就可以得出基因与性状的关系，而基因的多态性又与药物治疗有着密切的关系。为研究这些多态性差异，需要高通量、高灵敏度、高特异性且极为有效的差异检测方法，而这正是基因芯片的特点。利用芯片技术的高通量、大规模、平行性等特点可以有效的帮助研究人员进行新药的筛选，甚至包括对我国传统中药有效成分的筛选。基因芯片对于药物靶标的发现、多靶位同步高通量药物筛选、药物作用的分子机理、药物活性及毒性评价方面都有其它方法无可比拟的优越性，能

21、够从基因水平解释药物的作用机理，可以用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异，国外几乎所有的主要制药公司都不同程度地采用了基因芯片技术来寻找药物靶标查检药物的毒性或副作用。例如，Kapp U 等用包含 950 个基因探针的基因芯片比较何杰金氏病细胞系 L428 及 KMH2 与 EB 病的 B 淋巴细胞系 LGL-GK 的基因表达谱，发现何杰金氏病源的细胞系中自细胞介素-13（IL-13）及白细胞介素一 5（IL-5）表达异常增高，用 IL-13 抗体处理何杰金氏病源细胞系可显著抑制其增殖，此发现提示，IL-13 可能以自分泌形式促进何杰金氏相关细胞增殖,IL-13 及其信号传

22、导途径可能成为何杰金氏病治疗及药物筛选的新靶点。3.个性化给药 不同病人对同一药物有不同的反应，一直是困扰临床医学人员的一个难题。例如，临床上同样药物的剂量对病人甲可能有效，对病人乙不起作用，而对病人丙则可能有副作用，在药物疗效与副作用方面，病人的反应差异很大。但现已明确，这些差异是由基因多态性引起的，即药物反应的遗传多态性，可表现为药物代谢酶的多态性、药物转运的多态性、药物受体及药物标靶的多态性等。这些多态性的存在都有可能导致许多药疗中药物的药效和毒副作用的个体差异。例如细胞色素 P450 酶与大约 25广泛使用的药物的代谢有关，如果病人该酶的基因发生突变就会对降压药异喹胍产生明显的副作用，

23、有研究表明 510的高加索人就缺乏该酶基因的活性。现已弄清楚这类基因存在广泛变异，这些变异除对药物产生不同反应外，还与易犯各种疾病如肿瘤、自身免疫病和帕金森病有关。如果利用基因芯片技术对 患者先进行诊断，再开处方，就可对病人实施个体优化治疗。另一方面，在治疗中，很多同种疾病的具体病因是因人而异的，用药也应因人而异。利用基因芯片技术不仅可以检测药物反应多态性的基因差异，同时还可“钓出”药物应答基因，在基因水平上设计药物，避免病人服用低效、无效甚至有毒副作用的药物，使处方个性化，从而结束单一处方的时代。例如现用于治疗 AIDS 的药物主要是病毒逆转录酶 RT 和蛋白酶 PRO 的抑制剂，但在用药

24、3-12 月后常出现耐药，其原因是rt、pro 基因产生一个或多个点突变。Rt 基因有 4 个常见突变位点，4 个位点均突变较单一位点突变后对药物的耐受能力成百倍增加。如将这些基因突变部位的全部序列构建为 DNA 芯片，则可快速地检测病人是哪些基因发生突变，从而对症下药，所以对指导治疗和预后有很大的意义。相信在不久的将来，药品说明书上的适用症和禁忌症都会改为适用基因型和禁忌基因型，使得药品更加针对不同个体的不同疾病，达到疗效更佳、副作用更小的目的。4.预防医学 出生缺陷，也叫先天异常，先天畸形。它包含两个方面：一是指婴儿出生前，在妈妈肚子里发育紊乱引起的形态、结构、功能、代谢、精神、行为等方面

25、的异常；二是指婴儿出生后表现为肉眼可看见，或者辅助技术诊断的器质性、功能性的异常，如先天性心脏病、白血病、青光眼等。据统计，中国每年约有 80 万至120 万出生缺陷儿出生,占全部出生人口的 4%到 6%。而且多个省份统计显示，从2003 年开始，婴儿的出生缺陷率在不断上升。在随着卫生状况和生育医疗保健水平的提高，婴儿死亡率呈下降趋势，而出生缺陷所造成的胎儿和婴儿死亡比重在逐渐增加。出生缺陷已成为中国婴儿死亡的主要原因。出生缺陷不但能引起新生儿死亡，即使能够存活，大部分新生儿都会留有残疾，严重地影响着将来的生活质量，同时，给家庭造成的经济负担和精神痛苦是无法计算的。因此，中国政府将 9 月 1

26、2 日定为“中国预防出生缺陷日”。、利用基因测序和基因芯片技术，在婴儿出生前，可用进行有效的产前筛查和诊断，防止患有先天性疾病的婴儿出生。而在婴儿出生后，即可分析其基因图谱，不仅可预测出他日后可以长多高，还可预测其患某些疾病的潜在可能性有多大，以便采取预防措施。总之，作为基因测序和基因芯片作为两个重要的基因组学研究技术，在应用的某些方面存在重叠和竞争，但是在更多方面是优势互补，两种方法联合使用，将解决以前的单种技术难以解决的问题。例如目前新兴的序列捕获（Sequence Capture）技术，就是结合了芯片和测序技术，利用芯片探针捕获待测片段，再用二代测序技术分析核酸序列，利用高密度芯片和 4

27、54 测序仪曾成功的捕获了6726 个 500 碱基长度的外显子和 200kb 到 5Mb 的 DNA 区段，测序结果显示大多数的捕获 DNA 是符合设计要求的目的片段，该实验验证了序列捕获的特异性和可 行性，芯片的序列捕获技术将来有可能在对基因组区段测序的研究中取代多重PCR 过程。四、国内外形势分析 由于基因测序和芯片技术在医药领域的众多用途及其巨大的商业发展前景，各国政府都投入了大量资金进行研究，使这些技术进展十分迅速并取得了长足的进步。数据显示，全球生物产业销售额几乎每5 年翻一番，增长速度是世界经济平均增长率的近10 倍。预计到 2020 年，生物医药占全球药品的比重将超过1/3，而

28、这些与基因测序和基因芯片技术都有着密不可分的关系。近年来，我国也采取一系列措施加大对生物技术创新和生物产业发展的支持力度，包括出台生物产业发展“十一五”规划，组织实施生物技术创新成果产业化和加强国家生物产业基地建设等。作为生物产业的重点技术之一，包括基因测序和基因芯片在内的基因工程技术的发展正成为新的热点。日前，从在深圳召开的中国生物产业大会上获悉，由国家发展与改革委员会主导起草的 生物产业发展“十二五”规划进入最后论证阶段，据权威人士透露，其中明确提出，“十二五”期间，我国的生物产业要完成 10000 种微生物、100 种动植物组基因测序、发现约 500 个新的功能基因、转化应用 5 个以上

29、有重大经济价值的基因或蛋白，中国的基因测序市场将由此启动。按照每种微生物进行“基因组完成图”测序的费用为 30 万50 万元来看，基因测序带来的市场规模将达千亿元，7 只生物基因概念股将会因此受益。全球著名财经杂志福布斯也曾刊文指出，在中国，基因测序技术将构成一个千亿元规模的市场。据有关人士向上海证券报介绍，基因测序和芯片的医学价值已经明确，能对未来疾病风险给出判断。在美国的很多医院都已经开始向病人提供基因检测服务，并出现了一些独立的诊断服务实验室。从美国的经验来看，基因检测的费用在几百元至数千美元之间，消费者的接受度较高。而在国内，各种技术也已经越来越成熟，很多人都认为基因测序能力的强弱，在

30、某种程度上意味着一个国家在基因组研究上的实力，而我国至今为止已先后完成国际人类基因组计划“中国部分”、一部分国际人类单体型图计划、水稻基因组计划、家蚕基因组计划、家鸡基因组计划、抗 SARS 研究、“炎黄一号”、大熊猫等多项具有国际先进水平的基因组科研工作，奠定了中国基因组科学在国际上的领先地位。同时，建立了大规模测序、生物信息、克隆、健康、农业基因组等技术平台，其测序能力及基因组分析能力世界领先。但在实际应用方面，目前仍然只有少数几家三级甲等医院开始尝试此项工作，还未到大规模商业化推广的阶段，要市场完全接受并认可还需要一段时间。但我们完全有理由相信，不久的将来，人们就会意识到基因测序和基因芯片技术在个 体化诊断治疗、未来疾病的预防等方面对人们生活所带来的重大转变。并且，随着科学技术的进步，今后这两大技术必将继续协同配合推动生命科学研究进入新的纪元。