对虾病原检测基因芯片的设计与初步研制.pdf

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1、上海水产大学硕士学位论文对虾病原检测基因芯片的设计与初步研制姓名：许拉申请学位级别：硕士专业：临床兽医指导教师：黄倢20070401上海水产大学硕士学位论文对虾病原检测基因芯片的设计与初步研制摘要随着对虾养殖业的蓬勃发展，其病害也日益严重，对虾病害种类越来越多。病毒、细菌、立克次氏体、真菌等多种病原都能感染对虾，据不完全统计，目前己发现5 0 多种能感染对虾的病原，引起养殖对虾发病死亡，并且往往不是单一病原感染，病毒感染不仅常伴有细菌，而且可能是多种病毒同时感染。为此建立高通量、高速度、高灵敏度的对虾病原微生物检测技术显得格外重要本文分析筛选了对虾病原核酸序列后，设计和初步研制了能同时检测多种

2、对虾病原的基因芯片技术。根据L i g h t n e r 蓝皮书和我国养殖对虾的主要病害，选择对虾的9 种病毒、6 种细菌、1 种真菌和1 种立克次氏体为研究对象，在N C B I 中分别检索他们的核酸序列，进行B L A S T 搜索比对，O m i g a 软件A l i g n m e n t 多重比对，找出各种病原核酸序列的保守区和特异区序列，将筛选确定的各条序列，同时导入到微阵列(m i c r o a r r a y)专门的引物和探针设计软件A l l e l e l D3 0，根据引物和探针设计原则，在同一个任务下批量设计出退火温度等各项参数十分相似，扩增片段长度为2 0 0-

3、5 0 0 b p 的引物。再根据扩增片段序列，设计长度为5 T o p 的寡核苷酸探针。将设计好的引物和探针再通过B L A S T 搜索筛选确定其特异性后，由生物公司合成。本研究针对选择的研究对象，共设计了4 3 对引物和4 3 条相对应的寡核菅酸探针。其中包括以宿主对虾序列为模板设计的引物和探针，用来作为阳性对照。本文先针对部分引物进行了特异性验证实验，所采用的9 对特异性引物，分别以含有W S S V、m m、副溶血弧菌、仓伤弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌D N A为模板，均能特异性的P C R 扩增出与实验设计相符的产物，同时验证了用来作为检测D N A 病原的阳性对照。通过建立一步法

4、R T-P C R 方法，也验证了为检测R N A病毒的阳性对照。之后，采用同步P C R 方法和一步法R T-P C R 方法对各个目标序列进行地高辛标记，并测定标记浓度为8 0 I l I l l _ 一1 0 0 I l 山对虾病原检测基因芯片的设计与初步研制将合成后的探针按照设定的位置分布用手动点样仪点在带正电的尼龙膜上，经紫外交联后固定在膜上组成寡核苷酸膜芯片。将D I G 标记的扩增产物与膜芯片杂交实验中，首先验证了芯片上的寡核苷酸探针的杂交的特异性，无交叉杂交反应。之后设计了芯片上寡核苷酸探针的浓度梯度，与芯片杂交的D I G 标记产物浓度梯度以及杂交时间梯度实验，进行芯片杂交灵

5、敏度的摸索和杂交条件优化。结果显示：芯片上的寡核苷酸浓度为2 0 1 m a o l L 即能与D I G 标记产物发生明显的阳性显色反应；芯片能检测到1 6 n g l t l 浓度的D I G 标记产物，推算芯片的能检测到6 0 p g对虾病原D N A 和8 0 p g 的病原R N A；杂交时间只需2 h。采用膜芯片检测实验室保存的发病对虾样品，在2 0 0 6 年保样品中检测出W S S V、I H H N V、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌；在2 0 0 4 年的样品中检测出W S S V 和创伤弧菌。并且检测出感染2 0 0 6 年样品W S S V 核酸序列存在1 3 K

6、b的大缺失变异区，而2 0 0 4 年样品中不存在这个变异区。关键词：对虾，病原，基因芯片，设计，杂交，P(m上海水产大学硕士学位论文T e n t a t i v ed e s i g na n da p p f i c a t i o no fm e m b r a n eg e n e-c h i pf o rd e t e c t i o np a t h o g e ni np e n a e i ds h r i m pA B S T R A C TW i t ht h es h r i m pa q u a c u l t u r ei n d u s t r yf l o u

7、r i s hd e v e l o p m e n t，t h ep e n a e i ds h r i m pd i s e a s e sh a v ec a u s e ds e v e r ed a m a g et os h r i m p c u l t u r e A c c o r d i n gt oi n c o m p l e t es t a t i s t i c s，m o r et h a n5 0p a t h o g e n sh a v eb e e nf o u n di ni n f e c t e ds h r i m p，a n do f t e

8、 ni sn o tas i n g l ei n f e c t i o n,w h i l ev i r a li n f e c t i o na c c o m p a n i e dn o to n l yb a c t e r i a,b u tm a n yv i r u sm a yb ei n f e c t e di ns h r i m p S ot h ee s t a b l i s h m e n to fh i g ht h r o u g h p u t,h i 曲s p e e da n dI l i 曲s e n s i t i v i t yd e t e

9、 c t i o nt e c h n o l o g yf o rs h r i m pp a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s m si sp a r t i c u l a r l yi m p o r t a n t I nt h i sp a p e r,a f t e r 蠲a l y sa n df i l t r a t i o ns h r i m pp a t h o g e n i cn u c l e o t i d es e q u e n c e，d e s i g na n dp r e l i m i n a r yd

10、 e v e l o p m e n tg e n ec h i pt e c h n o l o g yf o rs i m u l t a n e o u sd e t e c t i o nm u l t i p l es h r i m pp a t h o g e n s A c c o r d i n gt oL i g h t n e r SB l u eB o o ka n dm a i ns h r i m pd i s e a s e si nC h i n a，c h o o s en i n et a p e so fs h r i m pv i r u s e s，s

11、 i xt y p e so fb a c t e r i a,af u n g a ls p e c i e sa n daR i c k e t t s i at os t u d y F i r s ts e a r c ht h e i rD N As e q u e n c er e s p e c t i v e l y，t h e nB L A S Ts e a r c ha n dA l i g n m e n tm u l t i p l ec o m p a r i s o ni nO m i g as o f t w a r e，i d e n t i 旬t h ep a

12、 t h o g e n i cs p e c i f i ca n dc o n s e r v e dn u c l e o t i d es e q u e n c e T h e ni m p o r tt h es e l e c t i v es e q u e n c e st oA l l e l c l D3 0s o f t w a r e，d e s i g np r i m e r sa n do l i g op r o b e sM e a n w h i l ei m p o r ti d e n t i f i e ds e q u e n c ei n t o

13、t h em i e r o a r r a ys p e c i f i cp r i m e r sa n dp r o b ed e s i g ns o f h,v a r eA I I e l e I D3 o i nt h es a m ep r o j e c t,t h ep r i m e l sw a sd e s i g n e dt ob ee v e r yp a r a m e t e r sa r cv e r ys i m i l a rs u c ha sa n n e a l i n gt e m p e r a t u r e，a n da m p l i

14、 f i e df r a g m e n tl e n g t h2 0 0 5 0 0 t I p，t h eo l i g o n u c l e o t i d ep r o b e sw 船d e s i g n e dt ob e5 7b pl e n g t hi na c c o r d i n gw i t ht h ep l 恤e r sa n dp r o b ed 髂i g np r i n c i p l e s D e s i g np r i m e r sa n dp r o b e st h r o u g ht h eB L A S Ts e a r c h

15、s c r e e n i n gt od e t e r m i n ei t ss p e c i f i c i t y，s y n t h e s i z e db yb i o l o g i c a lc o m p a n i e s I nt h i ss t u d y，4 3p a i r so fI i i对虾病原检测基因芯片的设计与初步研制p r i m e r sp a i r sa n d4 3c o r r e s p o n d i n go l i g o n u c l e o t i d ep r o b e sw e r ed e s i g n e d

16、,i n c l u d i n gs h r i m ph o s ts e q u e n c ea Sa t e m p l a t ed e s i g np r i m e r sa n dp r o b e su s e da Sp o s i t i v ec o n t r 0 1 I nt h i sp a p e r,s o m eo ft h ep r i m e r ss p e c i f i cv a l i d a t i o ne x p e r i m e n t sh a v eb e e nd e v e l o p e d T h en i n ep a

17、 i r so f p r i m e r st h es p e c i f i cP C Rp r o d u c tt h a tc o n s i s t e n tw i t ht h ee x p e r i m e n t a ld e s i g nw e r ea m p l i f i e db yn i n ep a i r so fp r i m e r sa g a i n s tW S S V，I I-t N V 9V i b r i op a r a h a e m o l y t i C l l 5，V i b r i ov u l n i f i c u s，

18、V i h r i oh a r v e y i，V i b i r oa l g n o t i c u sD N Aa St e m p l a t er e s p e c t i v e l y A tt h es a m et i m et h ep o s i t i v ec o n t r o lo f d e t e c t i o np a t h o g e nD N Aw a sv e r i f i e d T h r o u g ht h ee s t a b l i s h m e n to fo n e s t e pR T-P C Rm e t h o d,t

19、 h ep o s i t i v ec o n t r o lo f d e t e c t i o np a t h o g e nR N AW a Sv e r i f i e d T h e n,t h ev a r i o u st a r g e ts e q u e n c ew e r ed i g o x i nl a b e l e db ys y n c h r o n i z a t i o nP C Ra n do n e-s t e pR T-P C&a n dm e a S u r e dt h ec o n c e n t r a t i o ni s8 0 n

20、 g r d-l O O n g 斗1 T h es y n t h e s i z e dp r o b e sw a sp o i m e di n t op o s i t i v e l yc h a r g e dn y l o nm c m b r a n eb yM a n u a lG l a s sS l i d eA r r a y e rR e p l i e a t o r,a f t e rU Vc r o s s l i n k e dt h eo l i g o n u c l e o t i d em a m b m e-删W a Sb u i l t I nD

21、 I Gl a b e l e da m p l i f i c a t i o np r o d u c t sa n dm a m b 珀n ea r r a yh y b r i d i z a t i o ne x p e r i m e n t s，f i r s tt e s tt h eo l i g o n u c l e n t i d ep r o b eo nt h ec h i pl l y b r i d i z a t i 蛐s p e c i f i c i t y,n oc r o s s-h y b r i d i z a t i o nr e a c t i

22、 o n T h e nd e s i g nO l i g o n u c l e n t i d ep r o b e sc o n c e n t r a t i o ng r a d i e n t，D I Gl a b e l e dp r o d u c th y b r i d i z a t i o nc o n c e n t r a t i o ng r a d i e n ta n dh y b r i d i z a t i o nt i m ee x p e r i m e n tf o re x p l o r a t i o nc h i ph y b r i d

23、 i z a t i o ns e n s i t i v i t ya n do p t i m i z a t i o nh y b r i d i z a t i o nc o n d i t i o n s T h er e s u l t ss h o w e d：2 0 p m o l F LO l i g o n u c l e o t i d ep r o b ea b l et oh y b r i d i z a t i o nw i t hD I GP r o d u c th a v es i g n i f i c a n t l yp o s i t i v ec

24、o l o rr e a c t i o n；c h i pc a nd e t e c tt h ec o n c e n t r a t i o no f1 6 n g r t lD I Gl a b e l e dp r o d u c t,h y 晰dt i m et o o ko n l yt w oh o u r s U s i n gm e m b r a n e a r r a yd e t e c t i o nl a b o r a t o r yp r e s e r v e di n f e c t i o ns h r i m ps a m p l e W S S V

25、，I H H N V 9V i b r i op a r a h a e m o l y t i c u s,v i b r i oh a r v e y ia n dv i b i r oa l g n o t i c a sw e r ed e t e c t e di n2 0 0 6s a m p l e，W S S Va n dv i b r i ov u l n i f i c u sw e l t _ e&t e c t e di n2 0 0 4s a m p l e O t h e r w i s e，d e t e c t i o nt h eW S S Vs e q u

26、e n c ei nt w os a m p l ea r ed i f f e r e n t,b e c a u s ct h eW S S Vs e q u e n c e1 3K bv a r i a b l er e g i o n se x i s ti ni n f e c t e d2 0 0 6s a m p l eW S S Vn u c l e i ca c i ds e q u e n c e，b u tn o ti n2 0 0 4s a m p l e I V上海水产大学硕士学位论文K E Y W O R D Sp e n a e i ds h r i m p,p

27、a t h o g e n,g e n ec h i p,d e s i g n，h y b r i d i z a t i o n,P C RV上海水产大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：许拦日期：卿年石月I 日上海水产大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，

28、同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密曰学位沦文作者签名：南幸=苹乏指导教师签名：日期：沙印年6 月日。日期：年月日上海水产大学硕士学位论文引言海水养殖动物疾病的诊断随着近几年的技术发展，免疫学方法和分子生物学方法也得到了普遍应用。分子生物学中的核酸探针、斑点杂交和P C R 技术现在已普遍在海水养殖动物疾病检测中开发，通过不同方法的组合应用，可得到更高的灵敏度或准确率

29、，如D o t E L I S A、免疫酶标记检测核酸杂交、P C R-核酸探针杂交，而将荧光、标记、杂交和P C R 等技术完美结合的实时定量P C R 技术使人们更能对病原核酸能够在极广范围内进行精确定量，对水产动物病原的感染机理及病毒生态学研究都有极大的推动作用。近年来，海水养殖动物的诊断技术己向着同时检测多种病原方向发展，例如同时检测W S S V 和I H H N V 的P C R 技术、同时检测T S V、W S S V、I H H N V 的(R nP C R 技术等，这些技术的发展是人们看到了提高检测通量所带来的诱人效率。随着水产动物病原基础信息数据的日渐丰富，水产动物疾病诊断

30、技术的发展趋势不可避免地向着高通量技术方向跨越。生物芯片技术为人们提供了能对样品的生物信息进行高通量并行分析的技术核心手段，从刚诞生不久就立即得到了各发达国家政府的大力支持，将该技术列为重点发展领域。目前已形成了一批相关产业。2 0 0 5 年全球产值约2 3 亿美元。生物芯片之中，开发最早的微阵列技术易于为各分支学科所掌握，在疾病诊断方面得到了越来越多地应用，其中基因芯片具有通量易于扩充和灵敏度极商的优点。国外已用于人类的肿瘤早期诊断、遗传性疾病诊断、病毒(如肝炎病毒、流感病毒、H I V 等)和细菌的检测。生物芯片技术用于水产养殖动物疾病诊断方面的研究也在起步。国外有报道已研制构建成能检测

31、创伤弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、爱德华氏菌等鱼类病原菌的D N A 芯片。国内也有完成对I H N V、S V C V、I P N V、G C I-I V等1 2 种主要水生动物病毒建立P C R 基因芯片检测技术。本研究是以对虾病原(包括病毒、细菌、真菌)为研究对象，在G e n B a n k 中检索对虾病原的核酸序列，接着多重比对、分析、筛选其核酸序列，通过软件设计出特异性的引物和寡核苷酸探针，采用尼龙膜为片基，并摸索、优化P C R 和芯片杂交条件，初步构建能同时检测多种对虾病原的基因芯片。本论文设计和初步研制的对虾病原检测基因芯片技术打破现有对虾病原检测技术局限性大、效率低、系对虾病

32、原检测基因芯片的设计与初步研制统性差，只针对单一病原检测和诊断的特点，能快速的、高通量的检测和诊断对虾疾病，系统的、全面的反映对虾病害发生的原因和状况，更加有利于确定有效的预警和防治措施，保障对虾养殖业的健康持续发展。2上海水产大学硕士学位论文第一章文献综述第一节病原检测基因芯片应用及在水产病害检测的前景随着分子生物学相关学科的迅速发展，越来越多的微生物基因序列得到测定，基因序列数据库的信息量正在急剧增长。在上世纪9 0 年代初发展起来的基因芯片技术，在临床检测各种细菌和病毒等病原微生物，得到越来越广泛的应用，作为生物芯片技术一个发展最完备的分支，近十几年来，已经成为国内外研究的一个热点。目前

33、，随着水产养殖业规模的不断扩大和集约化程度的不断提高，各种病害也接踵而至，给海水养殖生产造成了重大损失。为此建立高通量、高速度、高灵敏度的病原微生物检测技术显得格外重要。基因芯片以其无可比拟的高通量、快速和准确的基因分析能力，而越来越受到人们的青睐。1 基因芯片概况1 1 基因芯片概念原理秘产生背景基因芯片(g e n ec h i p)又称D N A 芯片(D N A m i c r o a r r a y)，是专门用于核酸检测的生物芯片，也是目前运用最广泛的微阵列芯片。其概念来自计算机芯片，是指在固相载体(玻片、硅片或硝酸纤维素膜等)上按照特定的排列方式固定大量已知序列的D N A 片段或

34、寡核苷酸片断，形成微矩阵。将样品基因组D N A R N A 通过体外逆转录、P C R R T-P C R 扩增等技术掺入标记分子后，与位于微阵列上的已知序列杂交，通过激光共聚焦显微扫描技术或高性能冷冻C C D 显微摄像技术，检测杂交信号强度，经计算机软件进行数据的比较和综合分析后，即可获得样品中大量基因序列特征或基因表达特征信息【1 J。美国A f f y m c 扛i x 公司于2 0 世纪9 0 年代初率先开展了基因芯片的研究工作，生产了世界上第一块寡核苷酸芯片。1 9 9 5 年，美国斯坦福大学研制成功第一块以玻璃为载体的e D N A 基因芯片。1 9 9 8 年美国政府正式启动

35、基因芯片计划。在国内生物芯片技术起步较晚，1 9 9 7 年香山会议以来，我国才对生物芯片高度重视并制定了适合中国国情的战略。1 9 9 8 年l O 月，中科院将基因芯片列为“九五祷别支持项目。国家科技部医药生物技术“十五”及2 0 1 5 年规划所列1 5 个关键技术项目3对虾病原检测基因芯片的设计与初步研制中，就有8 个项目要使用生物芯片。2 0 0 2 年8 月国家科技部在8 6 3 高技术项目中正式启动了功能基因组和基因芯片重大专项。正在开发和已完成的有：肿瘤标志物检测蛋白质芯片、乙肝耐药基因检测基因芯片、丙肝病毒基因分型检测芯片、结核杆菌耐药性诊断芯片、艾滋病、梅毒、丙肝、乙肝四联

36、蛋白质芯片等。1 2 基因芯片的分类和检测优越性根据芯片载体上核酸分子的不同，可以分为寡核苷酸芯片和e D N A 芯片1 2-3 1。寡核苷酸芯片通常用原位合成法或合成后点样法将寡核酸探针固定在载体上，用来检测基因的突变、测序和诊断等。e D N A 芯片通常是用高速机械手把相对长的D N A 分子固定在载体表面，常用来做基因表达的研究 4 1。根据用途，芯片被分为测序芯片、表达谱芯片和诊断检测芯片。作为基因检测手段之一，基因芯片在微生物的鉴定、基因分型、快速诊断等方面有广阔的应用前景。它的优越性主要有：l、检测样品为各类致病基因片段，提高了检测效率；2、无需机体免疫反应，做到尽早诊断，且检

37、测样品用量少：3、诊断芯片技术是D N A 杂交技术和P C R 扩增技术相结合的分子诊断方法，有极高的灵敏度、特异性和可靠性；4、自动化程度较高，有利于大规模推广应用；5、寡核苷酸芯片还可用于对病原体进行基因分型1 5 1。2 细菌检测基因芯片的应用应用基因芯片诊断病原菌的原理，在于细菌的1 6 Sr R N A 基因的高度保守性。r R N A 基因包括3 3 k b 长的2 3 S、1 6 k b 长的1 6 S 和仅0 1 2 k b 长的5 s 三个基因。其中1 6 Sr R N A 基因的长度最合适，是目前最常被选用作为细菌鉴定和分类的基因。目前，凡乎所有已知细菌1 6 Sr R

38、N A 基因的碱基序列均被测定并存入基因库，由于R N A 易于降解，多采用检测1 6 Sr R N A 对应染色体上的1 6 Sr D N A 序列美国学者W a n g 根据人类肠道细菌的1 6 Sr D N A 序列，分3 个位点设计了6 0个4 0 m e r 长的寡核苷酸探针，点样在硝酸纤维素膜上，构建了膜芯片(M e m b r a n e a r r a y)。样品通过P C R 扩增并用D I G 标记后与芯片杂交，能检测出2 0种人类肠道细菌1 6 1。新生几败血症是儿科常见的全身细菌感染性疾病，发病率及病死率均较高。因而早期明确病原菌至关重要。郑季彦等对1 2 5 例拟诊为

39、败血症的新生儿血标本和部分脑脊液标本进行细菌1 6 Sr R N A 基因及基因芯片检测，证实实4上海水产大学硕士学位论文用基因芯片法检测败血症病原菌的阳性率明显高于血培养【7 1，利用基因芯片诊断败血症不仅可以诊断出此致病菌所属的科或属，而且可以诊断到种或亚种。可为新生儿败血症提供早期、敏感的病原学诊断依据嘲。吴雪琼等根据1 9 种分枝杆菌标准株的1 6 SR N A 序列设计寡核苷酸探针，制各D N A 微阵列，通过反向杂交技术鉴定1 9 种分枝杆菌标准株、9 种非分枝杆菌标准株和3 l 株分枝杆菌临床分离株带荧光标记的P C R 产物，该D N A 微阵列与9 神非分枝杆菌标准株不杂交，

40、可将1 9种分枝杆菌株鉴定到群或种，具有较高分枝杆菌特异性嘲。1 6 Sr D N A 是高度保守序列，常用于细菌分类，而1 6 S 2 3 Sr D N A 区域高度可变，适于临床分离分型，也有序列数据分析报道，核糖体2 3 Sr D N A 在临床重要致病菌种间的可变与1 6 Sr D N A 比较更明显，更有意义。李国军等根据大肠埃希菌、伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、李斯特菌等1 0 种细菌的核糖体2 3 S 亚基(2 3 Sr R N A)编码2 3 Sr D N A 的高度保守性和中间变异性，设计共同引物和探针，探针长度为2 2-2 5 个碱基，每个探针5 端加2 5 个T，制备寡核苷酸

41、芯片，用于快速检测临床常见致病菌【l o】。虽然r R N A 基因是最常用的细菌分类和鉴定基因，但r R N A 序列的高度保守性降低了r R N A 用于鉴定和分类的精度。因此，有必要寻找其他基因作为补充，提高分析精度。金惠英等选择霍乱弧菌特异的编码外膜蛋白的o m p W 基因和c t x 基因，设计引物和探针，并制备检测芯片，通过2 次P C R 扩增，制备荧光标记的靶序列，并与芯片杂交，检测霍乱弧菌和非霍乱弧菌病原体】。3 病毒检测基因芯片的应用目前病毒感染的诊断以经典血清学方法、现代免疫学技术和分子生物学方法为主，但在对那些遗传变异频繁的病毒感染进行诊断时，这些方法的程序复杂、工作

42、周期长，不利于快速诊断。P C R 技术应用以来，为病毒感染的诊断提供了高灵敏度的检测工具，但同时非特异产物的增多也容易导致临床诊断错误。在P C R基础上，利用核酸杂交特异性高的特点，基因芯片能通过平行分析P C R 扩增产物快速、准确地鉴别多种病原体，用于高通量、大规模的病毒检测和分型。“等在病毒感染的快速诊断方面进行了有益的尝试，其利用基因芯片技术对流感病毒感染的细胞的P C R 扩增产物进行分析，成功的鉴别了甲型、乙型流感病对虾病原检测基因芯片的设计与初步研制毒，并进行了分型【1 2】。除了流感病毒(甲、乙、丙各型)，鼻病毒、腺病毒、冠状病毒、合胞病毒等都能引起急性呼吸道感染。黄岩山等

43、根据呼吸道病毒相关序列设计合成6 0 m e t 长的寡核苷酸序列，构建检测芯片，对待检样品先进行随机逆转录和扩增，再与芯片杂交。证实此方法能直接检测多种呼吸道病原体及其亚型【1 3】。轮状病毒是导致全球婴幼儿重症腹泻的病原，C h i z h i k o v 等选取)7 的多个保守区域制各探针，成功地鉴定了A 组轮状病毒的G b-G 4、G _ 9 型，分析时间小于4 小时，并且每张芯片可同时进行1 0 个以上反应，临床价值重大【1 4 1。近年来，基因芯片技术开始应用到畜禽病毒检测上。口蹄疫、水泡性口炎、蓝舌病、鹿流行性出血热和赤羽病均属我国进境动物一类或二类传染病，其中口蹄疫、水泡性口炎

44、和蓝舌病还被国际兽疫局(O I E)确定为对动物和动物产品国际贸易有重大影响的A 类疾病。杨素等用分子克隆方法获得口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒和赤羽病病毒各一段高度保守的基因片断，点样到玻璃载体上，制备成检测芯片，可同时诊断上述5 种传染病，达到了快速、准确、敏感和多种病毒检测的目的旧吴时友等研制成可以同时检测鸡新城疫(N D)、禽流感(A i D、鸡传染性支气管炎(I B)等1 4 种鸡病毒病的低密度D N A 阵列芯片【1 6】。朱来华等通过分子克隆技术获得马疱疹病毒I 型、马动脉炎病毒、马流感病毒等5 种病毒各一段高度保守的特异性基因片段，用芯片点样仪逐点分

45、配到处理过的玻片上，制备成检测芯片，可同时检测和鉴别5 种马病毒。其灵敏度可达到约2 5 个病毒D N A 拷贝【埘。4 水产动物病原检测基因芯片的应用随着水产养殖的迅速发展，水生动物病害迅速蔓延。通过对水产动物病原的基因序列进行分析，找寻能代表同源序列和特异性片段的探针，构建检测基因芯片，可达到在一个芯片上对多种水产动物病原及血清型同时进行检测和鉴定的目的，不但大大缩短检测时间，而且能提高灵敏度和准确率，弥补其他分子生物学检测的不足。在水产动物疾病检测中应用基因芯片技术，国内外均处于开始阶段。刘荭在对传染性造血器官坏死病毒、鲤春血症病毒、传染性胰脏坏死病毒、草鱼出血病病毒等十二种主要水生动物

46、病毒建立和完善P C R 检测技术的基础上，结合G e n B a n k 中近年丰富起来的病毒核酸信息，采用基因芯片技术原理，建立起6上海水产大学硕士学位论文新的检测技术平台，达到了在一个载体上同时检测2 个样品和1 2 种水生动物病毒的目的1 1 8 1。G o n z f i l e z 等用多重P C R 和由9 种短核苷酸探针(2 5 m e t)构建D N A 芯片的方法，同时检测创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌等5 种海水鱼病原菌，7 种与病原菌染色体互补的探针检测灵敏度为1 0 0，2 种与病原菌质粒互补的探针灵敏度为6 7-8 3，能检测出 O 5 m l e m 2)O 1 S

47、 S C 0 1 S D S 洗两次(换袋进行)，每次1 5 m i r a 将膜放入上海水产大学硕士学位论文适量B u f f e r I(o 1 m o F L T r i s-H C l，O 1 5 m o l L N a C I，p H 7 5)中室温洗2 m i n；用0 2 5 m l(0 2 r e V e r e 2)B u f f e rn(1 m lB u f f e rI I 含5 m g 封闭剂和l m lB u f f e rI)室温封闭3 0r a i n；加入5 山(B u f f e r 体积的l 巧o)碱性磷酸酶标记的抗地商辛抗体0：1 0 0)，室温振荡反应

48、3 0m i n；将膜取出，用B u f f e rI 洗两次，每次1 5 m i n；再用B u f f e rI I I(O 1 m o l LT r i s-H C l，O I m o l L N a C I，p H9 5，0 0 5 m o l L M g c l 2 6 H 2 0)洗2 m i n；洗涤完毕，将膜芯片放入新杂交袋中，加入0 2 5 m l(o 2 m l e m)显色液(N B T-B C I P)q b 暗处显色1 5 m i n 一2 h，不要摇晃，可短暂取出观察，待样品显色而本底刚好不显色时取出膜，在蒸馏水或T E 缓冲液中浸泡3 0 m i n 终止显色，自

49、然晾干，肉眼观察，用L A S 3 0 0 0 凝胶成像系统(F u j iV i k n)拍照，封口保存。2 结果2 1 对虾病原检测膜芯片制各点样结果采用手动点样仪，把合成的、长度为5 7b p 的寡核苷酸探针，点样在带正电的尼龙膜，制备成4 x 3 x 3 的芯片，探针分布如图4 I 所示。图4-l 膜芯片探针分布图r i 9 4-1 S k e t d t m a p o f m e m b r a n e-a r r a yA 1：探针w-Ip r o b e；A 2：W-2p r o b e；A 3：W-3 p r o b e；A 4：I H H r lp r 0 6 eB 1：V

50、 I Bp r o b e；B 2：W-Ip r o b e；B 3：V P lp r o b e；B 4：V H-1p r o b ee l：、，A 一1p r o b e；C 2：P I S Sp m b e；C 3：P 1 6 Sp r o b e；C 4：B l a n k2 2 对虾病原检测膜芯片杂交特异性实验结果每种D I G 标记的扩增产物全部和分病原种类混合后分别与膜芯片进行杂交，N B T-B C I P 显色结果如图4-2 所示。各种D I G 标记的扩增产物都能与芯片上相对应的寡核苷酸探针发生反应，出现阳性结果。而与其他探针不发生反应，无交叉反应，结果见表4 2。对虾病原