环境微生物的分离与鉴定技术.ppt

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1、第八章 环境微生物的分离与鉴定技术1微生物纯培养的分离方法2微生物分类鉴定的经典方法3微生物的快速鉴定技术1.API细菌数值鉴定系统2.Enterotube系统4微生物的现代分类检测技术1.DNA碱基组成(G+C)mol%分析2.Biolog方法鉴定环境微生物群落技术3.16S rRNA序列分析技术4.核酸杂交技术5.DNA芯片技术6.DNA指纹图谱技术一、微生物纯培养的分离方法1.固体平板分离纯培养稀释平板法平板划线法单细胞分离法菌丝尖端分离法2.液体培养基分离纯培养3.利用选择培养基分离二、微生物分类鉴定的经典方法指长期以来在常规鉴定中普遍采用的一些关于形态、生理、生化、生态、生活史和血清

2、学反应等指标的鉴定方法。微生物分类鉴定的依据：形态特征个体形态特征培养特征生理生化特征常用的生化反应：糖发酵试验、VP试验、甲基红试验、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验、硫化氢试验、三糖铁(TSI)琼脂试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、氧化酶试验、过氧化氢酶试验、尿素酶试验等二、微生物分类鉴定的经典方法鉴定方法：一般先根据形态特征鉴别其属于哪一大类(细菌、放线菌、酵母菌或霉菌)再根据生理生化特征、生态特征、免疫特征和遗传特征等，借助于检索表或鉴定手册来依次确定是属于哪个目、科、属、种对于不同的微生物有不同的重点鉴定指标三、微生物的快速鉴定技术1.API细菌数值鉴定系统(简易诊检技术、

3、数码分类鉴定法)ADH ODC H2S TDA VP GLU INO RHA MEL ARAONPG LDC CIT URE IND GEL MAN SOR SAC AMY三、微生物的快速鉴定技术2.Enterotube系统美国Roche公司生产的Enterotube系统 Biolog法 Biolog测定原理：微孔板，每板含有96个孔，其中95个孔中加入了95种单一碳源和四唑染料，另外一个未加碳源的孔中加水为对照，环境微生物接种至孔中，孔中一旦有电子转移，四唑染料就会变为紫色，颜色的深浅可以反映环境微生物对碳源的利用程度 该方法由美国BIOLOG公司于1989年开发成功，至今已能鉴定包括细菌、

4、酵母菌和霉菌在内的2000多种病原微生物和环境微生物。三、微生物的快速鉴定技术四、微生物的现代分类检测技术3.Biolog法1.Biolog系统组成：96个孔微孔板 读数器：读取一波长下小孔内吸光度及变化 微机系统：与读数器相连，自动完成数据采集、传输、存贮与分析2.方法操作平板选择样品制备加样培育与读数3.数据分析四、微生物的现代分类检测技术1.DNA(G+C)mol%值的测定 DNA(G+C)mol%值是微生物(除少数以RNA为遗传物质的病毒)的一个基本遗传特征，对特定微生物来说，(G+C)mol%是恒定的。(G+C)mol%=(G+C)(mol)/(A+T+G+C)(mol)100%(G

5、+C)mol%的变化范围较广，原核生物为20-80，真核生物为30-60。完全不同的微生物可能有相近的(G+C)mol%，但(G+C)mol%有明显差异的微生物肯定不会属于同一个种。一般认为，种内菌株间(G+C)mol%相差不超过4%，属内菌株间相差不超过10%，相差低于2%时没有分类学意义四、微生物的现代分类检测技术1.DNA(G+C)mol%值的测定 DNA(G+C)mol%值可所用测定方法的不同和测定误差等而有差异 该方法操作简单，但分率力不高(G+C)mol%的测定方法热变性温度测定法(Tm法)纸层析法高效液相色谱法浮力密度法四、微生物的现代分类检测技术2.核酸杂交技术 核酸杂交是指具

6、有一定互补序列的两条核酸单链在液相或固相体系中按碱基互补配对原则缔结成异质双链的过程 DNA-DNA同源性分析DNA-rRNA同源性分析杂交方法固相杂交法：一是待测菌的DNA或RNA，二是用于检测的已知序列DNA或片段，即探针四、微生物的现代分类检测技术3.DNA芯片技术 1.DNA芯片技术是指将多达成千上万种的探针分子按照特定的排列方式固定在固相载体(多数采用玻片)上，组成密集的微点阵或阵列，利用核酸杂交原理，用已知序列的DNA分子，按照碱基互补配对的原则，与标记的特异性单链DNA或RNA分子杂交形成双链，通过检测杂交信号的强弱来判断样品中靶分子的数量，实现核酸序列的分子识别。2.DNA芯片

7、技术的最大优势是可以同时、快捷、准确地分析数以千计基因组的信息3.DNA芯片技术的改进使得DNA诊断不断小型化并具有高效率。四、微生物的现代分类检测技术4.16S rRNA序列分析技术 基本原理细菌体内有3种不同的RNA，即mRNA、rRNA和tRNA。它们分别行使着不同的功能，其中rRNA可将遗传信息得以表达，转译成蛋白质，它在所有细菌中都有一定的碱基序列和空间结构。细菌种类不同，rRNA序列不同。原核生物的rRNA是由两个亚基所组成：50S和30S，而30S亚基进一步由3种类型组成，即23S、16S和 5S rRNA，它们分别含有约 2900、1500和 120个核苷酸。16S rRNA相

8、对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，再加上16S rRNA可直接从DNA中转录而直接测序，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。四、微生物的现代分类检测技术4.16S rRNA序列分析技术 分析方法四、微生物的现代分类检测技术4.16S rRNA序列分析技术 分析方法从样品中分离总微生物DNAPCR扩增16S rRNA基因片段分析将PCR产物克隆到质粒载体上进行直接测序通过16S rRNA种属特异性的探针与PCR产物杂交以获得微生物组成信息对PCR产物进行梯度凝胶电泳分析，直接观察其多样性对PCR

9、产物进行DNA指纹图谱分析四、微生物的现代分类检测技术4.16S rRNA序列分析技术 应注意的问题提取的DNA要能够代表样品中环境微生物的遗传多样性防止核酸污染出现PCR假阳性结果克服混合环境微生物基因组DNA PCR出现的不均等扩增现象排除PCR产物中的嵌合序列避免探针杂交中出现的假阴性结果四、微生物的现代分类检测技术5.DNA指纹图谱技术限制性片段长度多态性分析(RFLP)其原理是利用适当的限制性内切酶在特定位点上将细胞基因组DNA切割成不同长度的片段，然后在琼脂糖凝胶上电泳分离后对所得图谱进行分析比较得出分类结论，以显示不同种群基因组DNA的限制性片段长度多态性。四、微生物的现代分类检测技术5.DNA指纹图谱技术随机扩增DNA多态性分析(RAPD)其原理是不同的基因组中与随意引物匹配的碱基序列的位点和数目可能不同，因而采用核苷酸序列的随机引物进行基因组DNA扩增，非特异性引物可以结合在模板DNA的多个位点，产生多个PCR产物，采用琼脂糖凝胶电泳将产物分离，将每株菌的每条引物下扩增后产生的图谱合成为针对一株菌的单一图谱，再通过软件进行分析。四、微生物的现代分类检测技术5.DNA指纹图谱技术扩增片段长度多态性分析(AFLP)其基本原理是通过PCR选择性扩增整个DNA的内切酶片段，在分辨率高的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，产生一组特异的DNA限制性片段的指纹图。