学习情境九微生物的分离纯化与保藏技术讲稿.ppt

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1、学习情境九微生物的分离纯化与保藏技术第一页，讲稿共三十八页哦微生物纯化、分离的原因微生物纯化、分离的原因n自然界中，微生物都是以自然界中，微生物都是以群居群居的方式存在的的方式存在的n在人为条件下培养的微生物群体称为在人为条件下培养的微生物群体称为培养物培养物(culture)n只有一种微生物的培养物称作只有一种微生物的培养物称作纯培养物纯培养物(pure culture)第二页，讲稿共三十八页哦纯培养的过程纯培养的过程n通过分离、纯化技术从混杂的天然微生物群中通过分离、纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物分离出特定的微生物n接种技术接种技术n无菌操作技术无菌操作技术第三页，讲稿共

2、三十八页哦一、接种技术一、接种技术接种工具接种工具接种和分离工具接种和分离工具1接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 第四页，讲稿共三十八页哦无菌技术无菌技术(aseptic technique)(aseptic technique)n在分离、转接及培养纯培养物时，防止其被其在分离、转接及培养纯培养物时，防止其被其它微生物污染的技术它微生物污染的技术n纯培养物纯培养物 环境环境第五页，讲稿共三十八页哦二、微生物分离纯化技术二、微生物分离纯化技术n分离分离(isolation)：从混杂微生物群体中获得只：从混杂微生物群体中获得只含有某一种微生物的

3、过程称为微生物分离与纯含有某一种微生物的过程称为微生物分离与纯化。化。n用固体培养基分离用固体培养基分离n用液体培养基分离用液体培养基分离n单细胞分离单细胞分离n富集分离富集分离第六页，讲稿共三十八页哦1.利用固体培养基分离利用固体培养基分离原理：原理：n微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体通常是由一个细胞繁殖而成的集合体n因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养第七页，讲稿共三十八页哦1.利用固体培养基分离利用固体培养基分离值得指出的是：值得指出的是：n在平板上的单个菌落并不一定保证是

4、纯培养在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养n因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定n有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到过程和多种特征鉴定才能得到 视频录像 http:/ plate method）先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如 1 10、1 100、1 1000）然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至 45

5、 左右左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出出菌落可出出菌落如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的繁殖形成的随后随后挑取该单个菌落挑取该单个菌落，或重复以上操作数次或重复以上操作数次，便可得到，便可得到纯培养纯培养第九页，讲稿共三十八页哦倾注平板倾注平板第十页，讲稿

6、共三十八页哦第十一页，讲稿共三十八页哦（2）涂布平板法（）涂布平板法（spread plate method）n将含菌的样品加入还比较烫的琼脂培养基，再倒平板将含菌的样品加入还比较烫的琼脂培养基，再倒平板，易造成某些热敏感菌的死亡易造成某些热敏感菌的死亡n某些好氧菌会在琼脂中间某些好氧菌会在琼脂中间缺氧影响生长缺氧影响生长第十二页，讲稿共三十八页哦涂布涂布 vs.倾注倾注第十三页，讲稿共三十八页哦(3)平板划线分离法（平板划线分离法（streak plate method）第十四页，讲稿共三十八页哦第十五页，讲稿共三十八页哦(3)平板划线分离法（平板划线分离法（streak plate met

7、hod）连续稀释的过程连续稀释的过程第十六页，讲稿共三十八页哦平板划线分离的方法平板划线分离的方法1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法第十七页，讲稿共三十八页哦2.2.用液体培养基分离纯培养用液体培养基分离纯培养稀释法原理：稀释法原理：n连续稀释，使一只试管里分配不到一个微生物连续稀释，使一只试管里分配不到一个微生物n如果大多数平行稀释管里没有微生物生长，那么如果大多数平行稀释管里没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物就是纯培养物有微生物生长的试管得到的培养物就是纯培养物第十八页，讲稿共三十八页哦3.3.单细胞挑取分离法单细胞挑取分离法 第十九页，讲稿共三十八

8、页哦4.富集分离法富集分离法利用选择培养基利用选择培养基q创造创造只让所需微生物生长的条件只让所需微生物生长的条件，所需微生物有效地与其他微生，所需微生物有效地与其他微生物竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。物竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。q所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等。经过多次重复移种，最后富集的菌株、渗透压和氢受体等。经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。很容易在固体培养基上长出单菌落。q如分离专性寄生菌，须把样品接种到相应敏感宿主细胞群中，使如分离专性寄生菌，

9、须把样品接种到相应敏感宿主细胞群中，使其大量生长。多次重复移种便可得到纯的寄生菌。其大量生长。多次重复移种便可得到纯的寄生菌。第二十页，讲稿共三十八页哦附：一些操作技术图片附：一些操作技术图片培 养第二十一页，讲稿共三十八页哦第二十二页，讲稿共三十八页哦倒平板倒平板第二十三页，讲稿共三十八页哦isolation plate第二十四页，讲稿共三十八页哦移接斜面划线接种点接种穿刺接种涂布接种液体接种注射接种第二十五页，讲稿共三十八页哦斜面接种时的无菌操作斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌接种灭菌(2)开启棉塞开启棉塞(3)管口灭菌管口灭菌(4)挑起菌苔挑起菌苔(5)接种接种(6)塞好棉塞塞好棉塞

10、第二十六页，讲稿共三十八页哦纯化（平板划线法）倒平板划线培养挑菌落纯种（纯培养）第二十七页，讲稿共三十八页哦任务二 微生物菌种保藏技术第二十八页，讲稿共三十八页哦一、菌种的衰退与复壮的一、菌种的衰退与复壮的 1.1.衰退：衰退：菌种在培养或保藏过程中，由于菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变自发突变的的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。第二十九页，讲稿共三十八页哦 常见的衰退现象常见的衰退现象：菌落和细胞形态的改变菌落和细胞形态的改变生长速度缓慢，产孢子越来越少生长速度缓慢，产

11、孢子越来越少 抵抗力、抗不良环境能力减弱等抵抗力、抗不良环境能力减弱等代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降第三十页，讲稿共三十八页哦 2 2、菌种的复壮菌种的复壮：使衰退的菌种恢复原来优良性状使衰退的菌种恢复原来优良性状第三十一页，讲稿共三十八页哦 菌种的复壮措施：菌种的复壮措施：纯种分离纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）；胞挑取法等）；通过寄主体内生长进行复壮通过寄主体内生长进行复壮（如（如Bacillus Bacillus thuringiensisthuringiensis的复壮）的复壮）；

12、淘汰已衰退的个体淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）；，以杀死生命力较差的已衰退个体）；采用有效的菌种保藏方法采用有效的菌种保藏方法。第三十二页，讲稿共三十八页哦 3 3、防止菌种衰退的方法、防止菌种衰退的方法：控制传代次数控制传代次数（一般在（一般在DNADNA的复制过程中，碱基的错配的复制过程中，碱基的错配率是率是5x105x10-4-4，自发突变的频率为，自发突变的频率为1010-8-81010-9-9，采用良好的菌，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）；种保藏方法，可以减少移种和传代的数）；选择合适

13、的培养条件选择合适的培养条件；采用不同类型的细胞进行传代采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）；采用稳定的单核孢子进行接种）；采用有效的菌种保藏方法。采用有效的菌种保藏方法。第三十三页，讲稿共三十八页哦 二、菌种保藏二、菌种保藏1 1、目的：、目的：存活，不丢失，不污染；存活，不丢失，不污染；防止优良性状丧失；防止优良性状丧失；随时为生产、科研提供优良菌种。随时为生产、科研提供优良菌种。第三十四页，讲稿共三十八页哦2.2.原理原理n选用优良的纯种选用优良的纯种（最好是休眠体，如分生孢（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等）子、芽胞等）

14、n创造创造降低微生物代谢活动强度降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受，生长繁殖受抑制抑制n难以发生突变的环境条件难以发生突变的环境条件（其环境要素是干（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养等）燥、低温、缺氧、缺营养等）n添加保护剂添加保护剂第三十五页，讲稿共三十八页哦 3.3.菌种保藏的方法菌种保藏的方法 菌菌 连续在培养基上（内）移种连续在培养基上（内）移种 种种 生活态生活态 传代培养保藏法传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种连续在活宿主上（内）移种 保保 固体斜面固体斜面 藏藏 湿法湿法 半固体琼脂柱半固体琼脂柱 方方 休眠态休眠态 液体介质液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）（蒸馏水、

15、糖液、其它溶液）法法 干法干法 藏在玻璃管内藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上吸附在合适的载体上第三十六页，讲稿共三十八页哦 方法：方法：低温保藏法：低温保藏法：方法：菌种管置方法：菌种管置44冰箱保藏，定时传代冰箱保藏，定时传代 。原理：低温下，微生物代谢强度明显下降原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 。石蜡油低温保藏法：石蜡油低温保藏法：橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。干燥保藏法干燥保藏法 将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土砂土管法管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。十年。第三十七页，讲稿共三十八页哦真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目目前最好的保藏方法前最好的保藏方法。液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196-196）。）。适用于各种微生物的适用于各种微生物的较理想的保藏方法较理想的保藏方法。第三十八页，讲稿共三十八页哦