【高中生物】微生物的选择培养和计数 课件 高二下学期生物人教版选择性必修3.pptx

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1、第一章第第2 2节节 微生物的基本培养技术及应用微生物的基本培养技术及应用第2课时：微生物的选择培养和计数1.科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶美国黄石公园问题探讨问题探讨水生栖热菌 聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于聚合酶链式反应（PCR）。讨论：1.筛选水生栖热菌的思路是什么样的？2.为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？耐高温的酶耐高温的酶寻找寻找耐高温的生物体耐高温的生物体寻找寻找高温环境（热泉、火山口）高温环

2、境（热泉、火山口）水生栖热菌能在水生栖热菌能在70708080的高温条件下生存，的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下而绝大多数微生物在此条件下不能生存。不能生存。一、选择培养基一、选择培养基1.1.概念：在微生物学中，将概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长允许特定种类的微生物生长，同，同时时抑制或阻止其他种类微生物生长抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。的培养基。2.类型：（1）利用改变培养条件进行选择培养。（2）利用添加某种化学物质进行选择培养。（3）利用营养缺陷进行选择培养。70708080的高温的高温分离耐高温的水生栖热菌分离耐高温的水生栖热菌加入青霉素加入青霉素分离

3、酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌加高浓度食盐加高浓度食盐金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌不加碳源（含碳有机物）的培养基不加碳源（含碳有机物）的培养基分离出自养型微生物分离出自养型微生物不加氮源的培养基不加氮源的培养基分离出固氮菌分离出固氮菌尿素CO(NH2)2含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥尿素分解菌分解尿素的原理：尿素分解菌分解尿素的原理：CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3脲酶1.1.如果让你配制一种培养基，让土壤稀释液中能分解如果让你配制一种培养基，让土壤稀释液中能分解尿素尿素的细菌分离出来，培养基的配方的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？该如何设

4、计？培养基的配方中应含有微生物生长所需的营养要素碳源、氮源、水、无机盐等。由于绝大多数微生物都能利用葡萄糖，分解尿素的细菌也能利用葡萄糖，可以用葡萄糖作为碳源，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，在培养基中加入尿素提供氮源，使培养基具有了选择作用。该培养基以尿素作为唯一氮源，只允许能以尿素作为氮源的微生物生长。2.2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？该培养基与普通培养基相比较，共同点是都认有机碳（如葡萄糖）作为碳源，都有水和无机盐；不同点是该培养基以尿素作尿素作为唯一氮源为唯一氮源，使只有能以尿素作为氮源的微生物生长稀释涂布平板法二、微

5、生物的选择培养二、微生物的选择培养1.1.稀释涂布平板法稀释涂布平板法:必须要对土样充分必须要对土样充分稀释稀释后，然后将菌液涂布到制备好的选择后，然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上。培养基上。将将10g土样加入盛有土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清上清液加入盛有液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次无菌水的试管中，依次等比稀释等比稀释。1101 mL1 mL1 mL1 mL1 mL1 mL1102110311041105110611079 mL 无菌水无菌水90mL无菌水无菌水在火焰旁将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇

6、匀，制成菌液。2.稀释涂布平板法的操作过程2.稀释涂布平板法的操作过程取0.1mL菌液，滴加到培养基表面将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温箱培养。入恒温箱培养。（1)各操作细节要保证“无菌无菌”。例如，移液管要经过灭菌。梯度稀释时，试管口和移液管应在离火焰12cm处，涂布器要经过灼烧灭菌等。（2)将涂布器浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后

7、将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。（3)操作中要注意防火。涂布结束后，应将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，以检测培养基是否灭菌彻底。注意事项注意事项稀释涂布平板法与平板划线法的比较平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法纯化原理纯化原理接种工具接种工具单菌落的获得单菌落的获得用途用途接种效果图接种效果图相同点相同点通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落接种环涂布器从最后划线的区域挑取稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落分离纯化菌种，获得单菌落分离纯化菌种，获

8、得单菌落用于计数都能分离纯化菌种；都是在固体培养基上进行的三、微生物的数量测定三、微生物的数量测定1.1.间接计数法间接计数法稀释涂布平板法稀释涂布平板法（1 1）原原理理：当当样样品品的的稀稀释释度度足足够够高高时时，培培养养基基表表面面生生长长的的一一个个单单菌菌落落，来来源源于于样样品品稀稀释释液液中中的的一一个个活活菌菌。通通过过统统计计平平板板上的上的菌落数菌落数，就能推测出样品中，就能推测出样品中大约含有多少活菌大约含有多少活菌。（2 2）计数原则）计数原则 一般选择菌落数为一般选择菌落数为3030300300的平板计数；的平板计数；在在同同一一稀稀释释度度下下，应应至至少少对对3

9、 3个个平平板板进进行行重重复复计计数数，然然后后求出求出平均值平均值。适当的稀释度适当的稀释度、涂布是否均匀涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。是成功统计菌落数目的关键。（3 3）结果分析：结果分析：统计的菌落数往往比活菌的实际数目统计的菌落数往往比活菌的实际数目少少；统计结果一般用统计结果一般用菌落数菌落数而不是用活菌数来表示。而不是用活菌数来表示。原因原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。（4 4）计算公式：计算公式：每每g g样品中的菌落数样品中的菌落数(CV)M(CV)M C C代代表表某某一一稀稀释释

10、度度下下平平板板上上生生长长的的平平均均菌菌落落数数；V V代代表表涂涂布平板时所用的稀释液的体积布平板时所用的稀释液的体积(mL)(mL)；M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。请计算：4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为 个。1.1108三、微生物的数量测定三、微生物的数量测定2.2.显微镜直接计数法：显微镜直接计数法：原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。方法：用计数板计算用计数板计算计算公式：每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数x400 x10 x400 x103 3x x稀释倍数稀释倍

11、数。缺点：不能区分死菌与活菌，造成统计值比实际值偏大。内容直接计数法间接计数法主要用具显微镜、细菌计数板或血细胞计数板涂布器计数依据细菌个数培养基上菌落数优点计数方便、操作简单计数的是活菌计算公式每毫升原液含菌株数每小格平均菌株数4001 0000稀释倍数每克样品中的菌株数:(CV)MC:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数缺点不能区分死菌与活菌当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落结果比实际值偏大比实际值偏小微生物的计数方法比较四、土壤分解尿素细菌的分离与计数葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.

12、1gMgSO47H2O0.2g琼脂15.0g蒸馏水1000ml配方：KH2PO4和Na2HPO4的作用是：提供无机盐；调节pH。常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。1.培养基的制备四、土壤分解尿素细菌的分离与计数2 2.实验步骤实验步骤（1 1）土壤取样）土壤取样 取样地点要求：酸酸碱碱度度接接近近中中性性的的潮潮湿湿土土壤壤。细菌适宜在该环境中生长。取样过程：铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部

13、分分布在距地表38cm的土壤层。注意事项取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30300之间，适于计数的平板。测细菌数：一般用104、105、106稀释液测放线菌：一般用103、104、105稀释液测真菌数：一般用102、103、104稀释液（2）样品的稀释与稀释涂布平板法接种选择一个比较宽的范围，将11031107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30300的平板进行计数在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30300的平板

14、进行计数？思考2.实验设计 每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）；整个实验还要设置2个平板：不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。注意事项：注意事项：本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标做好标记记。例如，在标记培养皿时应该注明。例如，在标记培养皿时应该注明组别组别、培养、培养日期日期和平板上培养样品的和平板上培养样品的稀释度稀释度等。等。不一定，还需要进一步的鉴定不一定，还需要进一步的

15、鉴定不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30-37的温度下培养1-2d。一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。（3）微生物的培养与观察得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？（5）结果分析 实验组：实验组：第3组接种的选择培养基 用以分离并计数能分解尿素的细菌 第4组接种牛肉膏蛋白胨培养基 用以判断选择培养基是否具有选择作用 对照组：对照组：第5组不涂布稀释液的选择培养基 用以验证培养基中是否含有杂菌 第6组牛肉膏蛋白胨培养基

16、用以验证培养基中是否含有杂菌 实验结果：前3组实验组分离得到单菌落 第4组得到多种菌落 第5、6组正常情况下无菌落2：在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗？1：样品的稀释操作是否成功？如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。不一定。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。讨论1.1.如表所示为某微生物培养基的配方。下列说法中不正确的是如表所示为某微生物培养基的配方。下列说法中不正确的是()()成分成分NaNO3K2HPO4KClMgSO47H2O含量含量3g1g0.5g0.5g成分成分FeSO4

17、（CH2O）H2O青霉素青霉素含量含量0.01g30g定容至定容至1000mL0.1万单位万单位A.此培养基属于液体培养基，其中的碳源是（CH2O）B.配制培养基时，溶化后必须要进行的是调整pH和灭菌C.接种时应在酒精灯火焰附近操作D.若用该培养基选择培养纤维素分解菌，应除去青霉素，加入纤维素粉练习练习D2.2.下图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的示意图下图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的示意图,有关叙述错误的是有关叙述错误的是()()A.在配制步骤、的培养基时,应先调pH值后高压蒸汽灭菌B.步骤 纯化分解尿素的原理是将聚集的细菌分散,可以获得单细胞菌落C.步骤 采用涂布平板法接种,并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素D.步骤 挑取 中不同种的菌落分别接种,比较细菌分解尿素的能力C