【高中生物】微生物的选择培养和计数课件 高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3.pptx

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1、1.21.2微生物的培养技术及应用微生物的培养技术及应用研究背景寻找耐高温的DNA聚合酶u1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。讨论：讨论：1.筛选水生栖热菌的思路是什么样的？筛选水生栖热菌的思路是什么样的？2.为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？耐高温的酶耐高温的酶耐高温生物体耐高温生物体高温环境高温环境（热泉、火山口）（热泉、火山口）寻找寻找水生栖热菌能在70-80高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去

2、寻找。现学现用1.在被石油污染的土壤中可以筛选 微生物2.在冰川冻土层可以筛选 微生物3.漆酶属于木质降解酶类，分离产漆酶菌株的首选样品是 生活污水吗？分解石油分解石油耐寒耐寒不是不是 由以上例子可知，由以上例子可知，某些微生物适应某些特定的环境条件，某些微生物适应某些特定的环境条件，而绝大多数微生物在这种条件下不能生存而绝大多数微生物在这种条件下不能生存，因此可以通过这，因此可以通过这个原理从环境中获得某种特定种类的微生物。个原理从环境中获得某种特定种类的微生物。怎样怎样选择选择出出抗氨苄青霉素能力抗氨苄青霉素能力的细菌的细菌?培养基中加培养基中加氨苄青霉素氨苄青霉素具有具有氨苄氨苄青霉素抗

3、青霉素抗性性的菌落的菌落没有没有氨苄氨苄青霉素抗青霉素抗性性的的细菌细菌培养基应培养基应有菌落有菌落没有没有氨苄青霉素抗氨苄青霉素抗性性的的细菌细菌被淘汰被淘汰选择培养基人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。类型条件分离得到的菌种添加某种化学物质加入青霉素加入青霉素高浓度食盐高浓度食盐特殊碳、氮源石油是唯一碳源石油是唯一碳源营养缺陷不加碳源不加碳源不加氮源不加氮源酵母菌、霉菌等真菌酵母菌、霉菌等真菌（青霉素可杀死细菌（青霉素可杀死细菌)金黄色葡

4、萄球菌金黄色葡萄球菌能分解石油污染的微生物能分解石油污染的微生物自养型微生物自养型微生物固氮菌固氮菌尿素CO(NH2)2含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥，尿素不能直接被农作物吸收，土壤中的细菌将尿素分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。土壤中的细菌分解尿素是因为他们能合成脲酶。CO(NH2)2+H2O 2NH3+CO2 脲酶选择培养基思考讨论1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？设计一种选择培养基,用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？现学现用牛肉膏牛肉膏5.0g蛋白胨蛋白胨10

5、.0gNaCl5.0g琼脂琼脂20.0g蒸馏水蒸馏水定容到定容到1000ml培养基一培养基一KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO47H2O0.2g葡萄糖葡萄糖10.0g尿素尿素CO(NH2)21.0g琼脂琼脂15.0g蒸馏水蒸馏水定容到定容到1000ml培养基二培养基二2.从用途上来讲，培养基二属于 培养基，目的是为了获得 。3.两种培养基共有的培养基成分有：。培养基一的碳源为 ，氮源为 ；培养基二的碳源为 ，氮源为 。1.从物理性质来讲，两者属于_培养基，判断依据是_，。该类培养基的主要用途为 。固体固体且比例为且比例为1.5%2%添加了凝固剂琼脂添加了凝固剂琼脂分离、鉴定、计

6、数分离、鉴定、计数选择选择能分解尿素的微生物能分解尿素的微生物碳源、氮源、无机盐、水碳源、氮源、无机盐、水牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨葡萄糖葡萄糖尿素尿素提供无机盐；提供无机盐；调节调节pH。思考：思考：怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性；则该选择培养基具有选择性；现学现用微生物的选择培养 如果想

7、知道如果想知道1g1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行行稀释稀释及科学的微生物及科学的微生物数量测定数量测定方法方法-稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。两个基本操作：两个基本操作：和和 。梯度稀释梯度稀释涂布平板涂布平板稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。微生物的选择培养土壤取样 细菌宜在酸碱度接近细菌宜在酸碱度接近中性中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表

8、距地表38cm38cm的土壤层。铲去表层土的土壤层。铲去表层土3cm3cm左右，取样，将样品装入左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。事先准备好的信封中。取土样时用的铁铲和取土样时用的铁铲和取样袋在取样袋在使用前都需要灭使用前都需要灭菌菌。操作完成后，一定要。操作完成后，一定要洗手。洗手。微生物的选择培养样品等梯度稀释将将10g10g土样加入盛有土样加入盛有90mL90mL无菌水无菌水的锥形瓶中，充分摇匀的锥形瓶中，充分摇匀，制成制成稀稀释释1010倍倍的土壤菌液。的土壤菌液。取取1mL1mL上清液上清液加入盛有加入盛有9mL9mL无菌水无菌水的试管中，依次等比稀释。的试管中，依次等比稀释

9、。1101 mL1 mL1 mL1 mL1 mL1 mL1102110311041105110611079 mL 无菌水无菌水90mL无菌水无菌水10g微生物的选择培养取样涂布取样涂布平板平板取取0.1mL 0.1mL 菌液菌液滴滴加到培养基表加到培养基表面面1101107 7移液枪将涂布器将涂布器浸浸在盛有酒精的在盛有酒精的烧杯中烧杯中将涂布器放在火焰将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽上灼烧，待酒精燃尽、涂布器、涂布器冷却后，再冷却后，再进行涂布进行涂布用涂布器将菌液均匀地涂布在培用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可养基表面。涂布时可转动培养皿，转动培养皿，使涂布均匀使涂布均匀微量

10、微量 移液器移液器各梯度分别涂布3个平板微生物的选择培养培养并观察培养并观察 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养1 12d2d恒温培养恒温培养箱箱恒温培养箱恒温培养箱 细菌一般选用细菌一般选用104、105、106 稀释稀释倍数的菌液进行涂布培养。倍数的菌液进行涂布培养。稀释稀释10103 3倍倍稀释稀释10104 4倍倍稀释稀释10105 5倍倍空白对照空白对照微生物的数量测定 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少

11、活菌。样品的样品的稀释度稀释度将直接影响平板上的菌落数目将直接影响平板上的菌落数目稀释稀释10103 3倍倍稀释稀释10104 4倍倍稀释稀释10105 5倍倍空白对空白对照照注意事项注意事项：为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组。（重复实验，减少误差）。分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。1.间接接计数法数法 稀稀释涂布平板法涂布平板法现学现用请计算：4号试管每克土壤中的活菌数约为 个。1.1108通

12、过稀释涂布平板法统计的细菌的数目与它的实际数目相同吗？统计的细菌数往往比活菌实际数目低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？不能，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。每克样品中的菌落数(CV)M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数平均菌落数，V V代表代表涂布平板时所用的稀释液的涂布平板时所用的稀释液的体积体积(ml)(ml)，M M代表代表稀释倍数。稀释倍数。比较比较平板划线法平板划线法稀释涂布平

13、板法稀释涂布平板法工具工具原理原理特点特点单菌落单菌落用途用途共同点共同点在数次划线后数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落将菌液进行一系列的梯度稀释，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞。涂布器单菌落易分开，可计数可计数，操作复杂都能分离纯化菌种都是在固体培养基上进行的接种环方法简单，但不适宜计数从最后划线的区域挑取稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落分离纯化菌种，获得单菌落分离纯化菌种，获得单菌落用于计数2.直接计数法 显微镜直接计数法 利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。缺点：不能区分死菌与活菌；

14、个体小的细菌在显微镜下难以观察；不适于对运动细菌的计数每毫升原液所含每毫升原液所含每毫升原液所含每毫升原液所含细细菌数每小格平均菌数每小格平均菌数每小格平均菌数每小格平均细细菌数菌数菌数菌数40010000400100004001000040010000稀稀稀稀释释倍数倍数倍数倍数注意：统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。（“染色排除法”）优点：快速、直观快速、直观内容直接计数法间接计数法主要用具显微镜、细菌计数板或血细胞计数板涂布器计数依据细菌个数培养基上菌落数优点计数方便、操作简单计数的是活菌计算公式每毫升原液含菌株数每小格平均菌株数4001 0000稀释倍数每克样品中的菌株数:(CV)M

15、C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数缺点不能区分死菌与活菌当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落结果比实际值偏大比实际值偏小土壤中分解尿素的土壤中分解尿素的细菌的分离和菌的分离和计数数1.实验目的（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。2.实验原理土壤取样土壤取样制备培养基制备培养基样品稀释与取样涂布样品稀释与取样涂布微生物的培养与观察微生

16、物的培养与观察3.实验过程土壤取样细菌宜在酸碱度接近细菌宜在酸碱度接近中性中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表38cm38cm的的土壤层。铲去表层土土壤层。铲去表层土3cm3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样时用的铁铲和取样取土样时用的铁铲和取样袋在袋在使用前都需要灭菌使用前都需要灭菌。操作。操作完成后，一定要洗手。完成后，一定要洗手。培养基的配置葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO47H2O0.2g琼脂15.0g蒸馏水1000ml牛肉膏蛋白胨培养基

17、：牛肉膏蛋白胨培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。作为对照组，来判断选择作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用培养基是否具有选择作用样品的稀释与涂布 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30300之间，适于计数的平板。测细菌数：一般用测细菌数：一般用10104 4、10105 5、10106 6稀释液稀释液测放线菌：一般用103、104、105稀释液测真菌数：一般用102、103、104稀释液还要有两个对照，即不接种的选择不接种的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。注意事项：注意事项：本实

18、验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明例如，在标记培养皿时应该注明组别组别、培养、培养日期日期和平板上培养样品的和平板上培养样品的稀释度稀释度等；等；微生物的培养与观察微生物的培养与观察（细菌一般在30-37的温度下培养1-2d）每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。结果分析与评价结果分析与评价1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以

19、及选择培养基是否筛选出一些菌落。2.你是否获得了某一稀释度下菌落数 为30300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？3.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。如果得到了两个或多个菌落数为30300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基

20、配制是否合理等方面查找原因。得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？不一定。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。原理：脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强 酚红变红脲酶阳性CO（NH2）2+H2OCO2+2NH3 脲酶在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。液体培养基：液体培养基：可以直接看液体的变色情况。可以直接看液体的变色情况。可以观察可以观察菌落周围是否出菌落周围是否出现红色环带，现红色环带，红色环带直红色环带直径与菌落直径比值越大，径与菌落直径比值越大，说明分解能力越说明分解能力越强强。固体培养基：固体

21、培养基：目标菌的鉴定鉴别培养基：鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。伊红和美蓝培养基鉴别大肠杆菌刚果红培养基鉴别纤维素分解菌鉴别培养基1、选择培养基项目项目选择培养基选择培养基鉴别培养基鉴别培养基原理原理用途用途举例举例图示图示允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与之发生反应培养、分离出目标微生物鉴别目标微生物培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑色)