相对定量分析.pptx

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1、1相对定量的原理相对定量的原理相对定量实验的分析方法相对定量实验的分析方法相对定量实验设计相对定量实验设计总结总结第1页/共50页2绝对定量绝对定量典型应用领域典型应用领域:特定物种鉴定(e.g.bacteria,virus)特定核酸样本检测(e.g.oncology research)检测病原体载量(e.g.legionella,anthrax)筛选抗生素抗性基因(e.g.MRSA,VRE)水质监测Relative QuantificationRelative Quantification典型应用领域典型应用领域:mRNA 表达水平的检测(e.g.细胞因子,肿瘤)基因定量(e.g.染色体缺失

2、)研究疾病的微小残留病灶(MRD)GMO 检测 PCR定量实验定量实验 概述概述相对定量相对定量第2页/共50页3相对定量相对定量PCR实验实验目的和要求目的和要求相对定量实验的目的是用于研究样本中某个或某些核酸表达水平的差异。优点：能够检测目的基因“量”的细微变化 长期实验及不同实验体系中所得数据能够进行比较目标目标需要进行研究的核酸需要进行研究的核酸(特定的特定的RNA或或DNA序列序列)内参内参在研究的所有样本中，拷贝数恒定不变的核酸序列在研究的所有样本中，拷贝数恒定不变的核酸序列(内源性对照内源性对照)第3页/共50页4相对定量相对定量原理原理(I)利用内参基因(=内源性对照)对样本间

3、的差异进行归一化处理StepStep 1:1:相同样品中的目标基因和参比基因的浓度StepStep 2:2:不同样品中目的基因的含量差别由参比基因校正参比基因可以修正：参比基因可以修正：样品起始量的差别样品中核酸回收率的差别样品中可能的RNA降解不同样品中核酸质量的差别加样差（目标基因浓度）（目标基因浓度）（参比基因浓度）（参比基因浓度）T=100T=100 T=10 T=10 T=10 T=10 =2 =2 =2 =0.2 =2 =0.2 R=50 R=5 R=50 R=50 R=5 R=50 =calibrator =calibratortreated cell 2treated cell

4、 2第4页/共50页参比基因的选择参比基因的选择理想的参比基因理想的参比基因:表达水平在所有样品中是持续、稳定的：正常组织 vs.肿瘤组织表达水平不受实验条件变化的影响：处理样本 vs.未处理的样本看家基因看家基因(Housekeeping genes)：编码有基础细胞功能的蛋白质-actinmultigene family;20 genes;1 active locus:hormones of tyroid gland20 pseudogenes:stomach tumorg-actinmultigene family;pseudogenesGAPDHmultigene family;10-

5、30 genes;200 in mouse:lung,pancreatic,colon cancermostly pseudogenes:insulin,EGF5.8S,18S,28S RNApseudogenes2-microglobulinno pseudogenes:Non-Hodgkin lymhoma abnormal expression in tumorsG6PDHno pseudogenes:kidney,stomach tumor:hormones,oxidant stress,growth factorsPBGDno pseudogenesaldolasepseudogen

6、esHPRTpseudogenesU3,U8,.Pseudogenesornithin:tumorsdecarboxylase.GeneGenomic structure/pseudogenesRegulation e.g.第5页/共50页使用校准品校准品样本(calibrator)对最终分析结果进行进一步的均一化校准同次实验中目的基因与参比基因的检测灵敏度校正不同次实验间 run to run&不同试剂批号lot to lot 差异相对定量相对定量原理原理(II)校准品样本：未处理的细胞系起始时间点的样本 正常组织样本第7页/共50页8相对定量的原理相对定量的原理 相对定量实验的分析方法相对

7、定量实验的分析方法相对定量实验设计相对定量实验设计总结总结第8页/共50页相对定量相对定量常规的常规的两种分析模式两种分析模式相对定量相对定量(以校正样本归一化处理以校正样本归一化处理)精确值精确值=带扩增效率校正带扩增效率校正 -method 近似值近似值=没有扩增效率校正没有扩增效率校正 CT 法法全部假设:E=2相对定量计算公式相对定量计算公式=2-CT 相对定量计算公式相对定量计算公式=ET CpT(C)-CpT(S)X ER CpR(S)-CpR(C)校正目标基因和内参基因 实际上不同的扩增效率第9页/共50页10PCR 定量实验定量实验N=N0 x 2nNnumber of amp

8、lified molecules N0initial number of moleculesnnumber of amplification cyclesE第10页/共50页N=No x ECp相对定量结果的计算方法相对定量结果的计算方法EFFICIENCY 扩增效率扩增效率ET=ER=2?第11页/共50页相对定量方法相对定量方法(1)Cp 法法默认扩增效率默认扩增效率 E=2，(-Cp)方法方法Calibrator Normalized Ratio =2CpT(C)CpT(S)x 2CpR(S)CpR(C)=2CpT(C)-CpR(C)-CpT(S)-CpR(S)=2Cp(C)-Cp(S)

9、=2-Cp第12页/共50页相对定量方法相对定量方法(1)Cp 法法该方法假设：该方法假设：目标基因和内参基因的目标基因和内参基因的PCR扩增效率相同扩增效率相同扩增过程在整个扩增过程在整个PCR反应中保持恒定不变反应中保持恒定不变(E=2)归一化的相对比率=2-Cp无需标准曲线无需标准曲线第13页/共50页PCR 扩增效率的影响因素扩增效率的影响因素目标基因和内参基因之间的PCR效率差异是由于:探针复性的差异染料淬灭系数的差异荧光共振能量传递效应（FRET）的效率差异cDNA合成效率的差异目标基因与内参基因之间的PCR效率差异会造成实验的显著误差当前有且仅有LightCycler相对定量软件

10、的独特算法可对效率差异进行校正实际上实际上 不是所有的PCR反应都能达到E2的理想扩增效率不是所有的PCR反应在整个过程中的扩增效率都保持恒定第14页/共50页PCR 扩增效率扩增效率PCR 扩增效率的差异存在于：扩增效率的差异存在于：不同模板及引物序列的差异不同的PCR体系不同次的PCR实验N=No x En,E=2?理想情况下扩增效率2Crossing Point Log Concentration样品 1 样品 2效率2 的标准曲线效率偏离2的标准曲线E=10-1/slope第15页/共50页16PCR 扩增效率的计算扩增效率的计算E=10-1/slope E=10-1/-3.703 E

11、=10 0.27 E=1.86E=10 E=10-1/slope-1/slope第16页/共50页相对定量方法相对定量方法(2)-Method通过标准曲线对扩增效率修正通过标准曲线对扩增效率修正标准曲线对样品做梯度稀释不需要已知样品浓度最为准确的相对定量结果最为准确的相对定量结果第17页/共50页相对定量方法相对定量方法(2)-Method扩增效率的校正显著降低了计算中的误差扩增效率的校正显著降低了计算中的误差 -Method 是罗氏诊断的独有算法，采用产物的实际扩增效率数值计算定量结果 校准样本校准后的浓度比校准样本校准后的浓度比 =E ET T CpT(C)-CpT(S)CpT(C)-Cp

12、T(S)X X E ER R CpR(S)-CpR(C)CpR(S)-CpR(C)第18页/共50页35相对定量的原理相对定量的原理 相对定量实验的分析方法相对定量实验的分析方法相对定量实验设计相对定量实验设计总结总结第35页/共50页36相对定量相对定量 实验设计实验设计-主要因素主要因素1.实验设计实验设计确定研究的目的基因 选定合适的内参基因（最好能多选取几个）优化反应条件 选择合适的样本及样本制备方法(包括对照样本的选取)2.实验验证实验验证确定实验的效果(动态范围&效率)3.分析方法的选择分析方法的选择简单相对定量分析高级相对定量分析第36页/共50页37一步法一步法 or 二步法二

13、步法 RT-PCROne-Step RT-PCR:逆转录&PCR扩增过程一次完成操作简单污染几率低快速引物的特异性要求高 Two-Step RT-PCR:逆转录和PCR扩增分别完成不同的引物选择(oligo dT,random hexamers,specific)cDNA便于长期保存第37页/共50页38目的基因目的基因&内参基因扩增方式的设计内参基因扩增方式的设计目的基因和内参基因分别在不同的反应管中扩增目的基因和内参基因分别在不同的反应管中扩增 表达水平差异很大表达水平差异很大目的基因和内参基因通过不同的目的基因和内参基因通过不同的run扩增扩增 PCR反应程序不同 不同的检测模式(e.g

14、.SYBR Green I)and reference(e.g.HybProbe format)目的基因和内参基因进行多重目的基因和内参基因进行多重PCR扩增扩增(dual color)多重荧光扩增会降低动力学范围 比较单色扩增和双色扩增时目的基因与内参基因的动力学范围第38页/共50页39Calibrator Normalized Relative Quantification 设置设置无扩增效率校正(E=2):简单方法有扩增效率校正:高级相对定量 双标法效率效率影响因子Determination of a correction factor and/or a multiplication

15、factor单色(目的基因和内参基因在不同的反应管或反应孔)双色(目的基因和内参基因在同一个的反应管或反应孔)flexible Pairing“of target and reference samples(multiple housekeeping genes)反应的设置反应的设置校准样本校准样本选择合适的校准样本第39页/共50页40LightCycler 相对定量分析相对定量分析WorkflowEstablished LightCycler PCR for target and reference geneDetermination of a calibratorLC run with

16、samples and calibrator(target/reference)AnalysisBasicAdvanced第40页/共50页41相对定量实验设计相对定量实验设计Workflow Example(1)1.1.ExperimentExperiment DesignDesign Identification of the target gene(s)of interest and suitable reference gene(s)e.g.:target 1,target 2housekeeping gene(HK)1,housekeeping gene(HK)2Optimizati

17、on of reaction conditionse.g.:use LightCycler 480 Probes Master together with UPL probe and primersselect the appropriate run protocol(make use of“New Experiment from Template”)Selection and preparation of sample material,including a calibrator samplee.g.:untreated sample(=calibrator)5 samples treat

18、ed with different agents always include a NTCstart with cDNA prepared by Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(2-step RT-PCR)Set up experimente.g.:monocolor reactiontarget and HK PCR on one MWP第41页/共50页42Relative Quantification Assay Set Up Workflow Example(2)2.2.ExperimentExperiment Validati

19、onValidationDetermination of assay quality(dynamic range&efficiency)for each target and each reference gene3.3.MethodMethod SelectionSelection forfor AnalysisAnalysisBasic Analysisfast tracking solution for well performing assaysconvenient CT MethodAdvanced Analysishigh confidence solution for most

20、challenging assays!particular E-Method benefit of standard curves(linear,non-linear standard curve fitting;fixed dynamic range)benefit of in-run standard(inter-assay calibration)第42页/共50页43相对定量的原理相对定量的原理相对定量实验的分析方法相对定量实验的分析方法LightCycler Software操作操作相对定量实验设计相对定量实验设计总结总结第43页/共50页44通过内参基因均一化通过内参基因均一化 校

21、正不同样本来源核酸质量及含量的差异通过校准样品均一化通过校准样品均一化 校正不同实验批次以及不同试剂批号之间的差异 扩增效率的考量扩增效率的考量 无扩增效率的校正无扩增效率的校正 E=2 E=2 in case PCR efficiencies of target and reference are in case PCR efficiencies of target and reference are different and Edifferent and E2 2 edit E valueedit E valuestandard curves in run or import of st

22、andard standard curves in run or import of standard curve objectscurve objectslinear or non-linear standard curve(fit linear or non-linear standard curve(fit depending on data)depending on data)相对定量软件的特点及优势相对定量软件的特点及优势第44页/共50页45相对定量分析方法相对定量分析方法 流程流程Basic Analysisone clickFinal ResultAdvanced Analys

23、isFinal Resultdefine analysis settingsselect various parameters like quant type,standard curves pairing rule,reference runsubset editing adjustmentscombinable as templateadjustments第45页/共50页Doing now what patients need next第48页/共50页49Types of QuantificationReal-Time PCR Quantification PrinciplesReal

24、-Time PCR Quantification PrinciplesAbsoluteAbsolute QuantificationQuantificationRelative QuantificationRelative QuantificationExternal StandardsExternal Standards(monocolor)(monocolor)ExternalExternalStandardsStandards(without calibrator)(without calibrator)Calibrator-Normalized MethodCalibrator-Normalized MethodwithoutwithoutEfficiency Correction(Efficiency Correction(C CT T)-)-MethodMethodwithwithEfficiency Correction(-Efficiency Correction(-Method)Method)External Standards with External Standards with Internal Control(dual-color)Internal Control(dual-color)第49页/共50页