猪用生物制品及相关猪源原辅材料中非洲猪瘟病毒核酸检测方法.docx

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1、附件猪用生物制品及相关猪源原辅材料中非洲猪瘟病毒核酸检测方法1 适用范围1.1 猪用及采用猪源原辅材料制备的生物制品成品及半成品。1.2 猪源毒种。 1.3 猪源细胞及相关制品生产用细胞。1.4 其他猪源原辅材料（如组织、血清、胰酶衍生物等） 。2 取样和处理2.1 疫苗2.1.1 活疫苗 取至少 2 瓶样品，按瓶签注明头份用适宜稀释液分别稀释成 10 头份/0.2ml，等量混合，取混合液进行核酸提取。2.1.2 灭活疫苗 取至少 2 瓶样品，等量混合后进行以下处理。2.1.2.1 油佐剂灭活疫苗 取 36 ml 混合疫苗，加入正戊醇 4.0 ml，充分振荡混合 1 分钟，28冰箱静置不少于

2、60 分钟，直至油相和水相分离。取水相进行核酸提取。2.1.2.2 水性佐剂灭活疫苗2.1.2.2.1 铝胶佐剂灭活疫苗 取混合疫苗 5.0 ml，摇匀，加入0.25 g 解离剂 CPG-odn（人工合成的寡聚核苷酸） ，放入摇床（200 r/min）37解离 1 小时，5000 r/min 离心 10 分钟，取上清液进行核酸提取。2.1.2.2.2 其他水性佐剂灭活疫苗 直接取混合样品进行核酸提取。2.2 其他生物制品和半成品冻干类制品，按活疫苗进行取样和处理；液体制品及半成品，取至少 2 份（瓶）样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。2.3 猪源毒种 取至少 2 支毒种。冻干毒种，按冻干前

3、体积复溶后等量混合，取混合液进行核酸提取；非冻干毒种，等量混合后直接取混合液进行核酸提取。2.4 猪源细胞 除另有规定外，取至少 2 瓶细胞浓度不少于107.0个细胞/ml 的细胞悬液进行核酸提取。2.5 其他猪源原辅材料2.5.1 猪组织 每种组织，分别取样和处理。取不少于 2.0 g 组织，研磨后用 5 倍体积灭菌 PBS 悬浮，70灭活 30 分钟，4下以20003000 g 离心 10 分钟，取上清液进行核酸提取。2.5.2 猪血清 每批血清取至少 2 个最小包装的样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。2.5.3 猪胰酶 干粉状胰酶，取至少 2 份样品，根据使用情况分别配制成不低于 2

4、.5%浓度的溶液，等量混合，取混合液进行核酸提取；液体胰酶，取至少 2 个最小包装的样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。2.5.4 其他猪源衍生物 固体、液体或干粉状猪源衍生物，可分别按组织、血清或干粉状胰酶的方法进行取样和样品处理。3 核酸提取3.1 试剂和器材3.1.1 试剂 根据核酸提取方法确定，如氯仿、异丙醇、无水乙醇、0.1 mol/l 柠檬酸钠（含10%乙醇）、75%乙醇等。3.1.2 仪器 核酸含量测定仪；常温台式离心机；旋涡振荡器；水浴锅；微量移液器1套（最大量程分别为10 l、100 l、200 l、1000 l）。3.1.3 耗材 1.5 ml带盖离心管、无菌吸头（010

5、 l、0200 l、1001000 l）、一次性乳胶手套。3.2 操作程序（TRIZOL法），也可以选择其他等效核酸提取方法提取样品中的DNA。3.2.1 取样品 250 l，加入 750 l Trizol，颠倒混匀，室温放置5 分钟。3.2.2 加入200 l 氯仿，充分混匀，室温放置10 分钟，4下以12000 g 离心 15 分钟。3.2.3 弃去上清液，加入 220 l 无水乙醇，颠倒混合，1530放置 23 分钟，28以 2000 g 离心 5 分钟，沉淀物为 DNA。3.2.4 弃去上清液，加入含 10%乙醇的 0.1 mol/l 柠檬酸钠 750 l 洗涤 DNA，1530放置

6、30 分钟，28以 2000 g 离心 5 分钟。重复一次。3.2.5 加入 75%乙醇 1.2 ml，重悬 DNA 沉淀，1530放置 20分钟，42000 g 离心 5 分钟。可重复一次，充分洗涤 DNA 沉淀。3.2.6 弃去上清液，敞开离心管管口，在空气中干燥 510 分钟，加入 3050 l 的无核酸酶灭菌水溶解 DNA，20以下保存备用。3.3 注意事项3.3.1 核酸提取试剂具有腐蚀和强变性能力，应做好个人防护，佩戴手套、口罩和护目镜，防止液体飞溅到皮肤和眼睛。3.3.2 后续的核酸检测敏感性很高，要防止样品之间相互污染，最好使用带滤芯的枪头，且每次吸取取液体时均需更换枪头。3.

7、3.3 为防止核苷酸降解，应避免核酸酶污染，使用的耗材均需无核酸酶。3.3.4 做好剩余样品的无害化处理及操作台面的消毒处理。剩余样品可通过高压灭菌或煮沸处理，也可放在 1%卫可或 2%氢氧化钠消毒液中浸泡处理，操作台面使用 1%卫可擦拭。3.3.5 提取后的 DNA 样品要用锡箔纸封存，取样时应用枪头直接刺破锡箔纸取样，防止污染。4 检测下列两种方法可任选其一。4.1 实时荧光定量 PCR 检测法4.1.1 试剂和器材4.1.1.1 试剂4.1.1.1.1 荧光定量PCR试剂 本操作中以Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays kit为

8、例，也可选用其他荧光定量PCR试剂。4.1.1.1.2 扩增引物及探针扩增引物：ASF-05-Zsak-1466F（10 mol/ L）：5-CCTCGGCGAGCGCTTTATCAC-3 ASF-05-Zsak-1528R（10 mol/ L）：5-GGAAACTCATTCACCAAATCCTT- 3 探针ASF-05-Zsak-1486prob (10 mol/ L)：5-FAM-CGATGCAAGCTTTAT- MGB-34.1.1.1.3 无核酸酶的灭菌水 PCR级别。4.1.1.2 仪器 荧光定量PCR仪；微量移液器1套（最大量程分别为10 l、100 l、200 l、1000 l）

9、。4.1.1.3 耗材 1.5 ml带盖离心管、0.2 ml薄壁PCR管、荧光定量PCR 96孔板、0.1 ml荧光PCR八连管、无菌吸头（010 l、0200 l、1001000 l）、一次性乳胶手套。4.1.2 操作程序4.1.2.1 样品DNA制备 按照前述方法进行核酸提取。4.1.2.2 反应体系的配制 配制比样品数量至少多4个的反应体系，同时设置强阳性、弱阳性和阴性对照。在强阳性和弱阳性对照反应管中分别加入含有非洲猪瘟P72基因的标准质粒DNA各3 l，在阴性对照反应管中加入3l无核酸酶灭菌水。每个PCR反应管中应包含以下成分：成分成分体积（体积（l）2ABI TaqMan Gene

10、 ExpressionMix10ASF-05-Zsak-1466F（10 mol/ L）1ASF-05-Zsak-1528R（10 mol/ L）1探针(10 mol/ L)0.8DNA3无核酸酶灭菌水4.2总量204.1.2.3 反应程序 将所有待检样品和强阳性、弱阳性、阴性对照反应管放在荧光定量 PCR 仪中，按照以下程序进行扩增：502 分钟，955 分钟，9515 秒，58退火延伸 1 分钟，45 个循环（荧光信号收集在此阶段每次循环的退火延伸时进行） 。4.1.2.4 结果判定4.1.2.4.1 阈值设定 试验操作结束后，确定Ct值。Ct值为每个样品反应管内荧光信号到达设定阈值时所经

11、历的循环数。阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点为准。4.1.2.4.2 质控标准对照组的检测结果应符合以下情况，此次检测方为有效：阴性对照无Ct 值，且无扩增曲线。强阳性对照的Ct 值应在1822之间，并出现典型的扩增曲线。弱阳性对照的Ct 值应在3335之间，并出现典型的扩增曲线。4.1.2.4.3 判定阴性：无Ct值，且未出现扩增曲线，判定为样品中无ASFV核酸。阳性：Ct值40，且出现典型的扩增曲线，判定为样品中存在ASFV核酸。可疑：Ct 值40，且出现典型扩增曲线，判定为可疑，应重检。重检后，Ct 值40 且出现典型扩增曲线者判为阳性，其

12、他情况均判定为阴性。4.2 普通 PCR 检测法4.2.1 试剂和器材4.2.1.1 试剂4.2.1.1.1 PCR试剂 10PCR缓冲液（含25 mmol/l Mg2+），DNA扩增酶，dNTP预混液。4.2.1.1.2 扩增引物primer PPA-1（10 mol/L）：5-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3 (上游引 物)； primer PPA-2（10 mol/L）：5- CCCTGAATCGGAGCATCCT-3 (下游引物)。4.2.1.1.3 DNA分子量标准品 DL500。4.2.1.1.4 TAE电泳缓冲液 配制方法见电泳液标准配制流程。4.2.1.1.5 1%

13、琼脂糖凝胶板 在100 ml 1TAE缓冲液中加入1g琼脂糖，加热融化，加入5.0 l (10 mg/ml)溴化乙锭，混匀，倒入水平放置的凝胶盘中，胶板厚度达5.0 mm左右。根据样品数量选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔)，放入电泳槽中，加1TAE缓冲液淹没胶面。4.2.1.2 仪器 DNA扩增仪，稳压稳流电泳仪，水平电泳槽，凝胶成相系统（或紫外透射仪），微量移液器1套。4.2.1.3 耗材 1.5 ml带盖离心管、0.2 ml薄壁PCR管、无菌吸头（010 l、0200 l、1001000 l）。4.2.2 操作程序4.2.2.1 样品DNA制备 按照前述方法进行核酸

14、提取。4.2.2.2 反应体系的配制 配制比样品数量至少多3个的反应体系，同时设立阳性和阴性对照。在阳性对照反应管中加入非洲猪瘟P72基因重组质粒2.0 l，在阴性对照反应管中加入2.0 l无核酸酶灭菌水。每个PCR反应管中应包含以下成分：成分成分体积（体积（l）10PCR缓冲液2DNA 扩增酶1dNTP0.5 PPA-1 (10 mol/L)1 PPA-2 (10 mol/L)1 DNA2 无核酸酶灭菌水12.5 总量204.2.2.3 反应程序 将所有待检样品及阳性和阴性对照反应管放在PCR仪中，按照以下程序进行扩增：942分钟，9430秒，6030秒，7230秒，35个循环；7210分钟

15、。4保存。4.2.2.4 PCR扩增产物分析 取PCR扩增产物10 l，加6加样缓冲液2.0 l，混匀，用1.5%琼脂糖凝胶对混合物进行电泳分析，电压120V，电流50 mA，电泳时间30分钟。电泳结束后，用凝胶成像系统拍照，记录检测结果。4.2.2.5 结果判定4.2.2.5.1 质控标准对照组的检测结果应符合以下情况，此次检测方为有效：阴性对照应不出现257bp的特异性条带。阳性对照应出现257bp的特异性条带。4.2.2.5.2 判定阳性：待检样品出现与阳性对照大小一致的扩增条带，判定为非洲猪瘟病毒核酸阳性，扩增产物可通过DNA测序进一步确定基因型。阴性：待检样品未出现与阳性对照大小一致的扩增条带，判定为非洲猪瘟病毒核酸阴性。4.3 注意事项4.3.1 检测过程中应遵循 PCR 实验分区原则，即应区分试剂配制区、样本处理区、核酸扩增区。4.3.2 应避免在含有靶序列的区域中使用引物，防止污染靶序列。