细胞核和线粒体的分离和观察.pptx

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1、细胞器分离基本步骤细胞器分离基本步骤二、实验原理二、实验原理细胞破碎分离、纯化细胞器鉴定第1页/共18页（一）细胞破碎的方法（一）细胞破碎的方法1.杆状玻璃匀浆器法2.高速组织捣碎机法3.超声波处理法4.化学裂介法5.反复冻融法二、实验原理二、实验原理第2页/共18页细胞破碎的注意事项：细胞破碎的注意事项：1 1、匀浆介质：、匀浆介质：常用介质是缓冲的常用介质是缓冲的蔗糖水溶液蔗糖水溶液（0.25mol/L）。它比较近细胞质的分散相，具。它比较近细胞质的分散相，具有足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰有足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小，在小，在pH7.2-7.4pH7.2-7

2、.4的条件下细胞器不易发生聚集。的条件下细胞器不易发生聚集。2 2、尽可能在低温、尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。条件下进行，避免酶失活。3 3、若是采用、若是采用低渗方式低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀液中的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束不要超过浆结束不要超过5 5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长，导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种时间太长，导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。物质降解。第3页/共18页（二）分离纯化的方法（二）分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、

3、密度等物理特性根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，差异，离心离心成为亚细胞组分分离过程中最广泛应成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术用的技术 离心离心是利用旋转运动的离心力以及物质的是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法纯的一种方法 主要包括主要包括差速离心、密度梯度离心差速离心、密度梯度离心等方法。等方法。二、实验原理二、实验原理第4页/共18页差速离心法根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别，分级增加离心力，从试样中依次分离出不同组分的方法。从低速到高速逐级沉淀分离，一般用于分离沉降系

4、数相差较大（10倍及以上）的颗粒。优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：分离效果差，不能一次得到纯颗粒；须经反复悬浮和离心加以纯化。壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。第5页/共18页第6页/共18页密度梯度离心下次课讲第7页/共18页（三）细胞器的鉴定分析（三）细胞器的鉴定分析 分析分级分离得到的组分，可用分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定法进行形态和功能鉴定。细胞器标记酶细胞器标记酶的测定是评价细胞器

5、内膜组分和分离纯度的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如的主要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使该酶使詹纳斯绿詹纳斯绿B B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。（也而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。（也可使用罗丹明可使用罗丹明123123或或MitoTrackerMitoTracker等荧光探针标记法等）等荧光探针标记法等）细胞核：细胞核：DNADNA亚甲基蓝、甲苯胺蓝、亚甲基蓝、甲苯胺蓝、HoechstHoechst染料染料等等第8页/共18页方法和步骤

6、方法和步骤（一）细胞核的分离提取 1、肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。2、称取肝组织1 g，剪碎；用预冷的0.25 molL蔗糖-0.05molL Tris-HCI缓冲液，pH7.4（0.25moll蔗糖0.003moll氯化钙）溶液洗涤数次。第9页/共18页 3、按每克肝加8ml-9ml预冷的0.25molL蔗糖 0.05m/L Tris-HCI溶液，用高速组织匀浆器匀浆（已完成）4、取一定量匀浆液，在04冰浴中用玻璃匀浆器将肝再次匀浆（匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转

7、动研磨）（因已事先匀浆，本步骤研磨次数和时间可缩短）5、肝匀浆用双层纱布过滤，滤液制一张涂片,自然干燥.第10页/共18页第11页/共18页6 6、滤液以、滤液以2500rpm2500rpm，离心，离心1515分钟；分钟；(1)(1)缓缓取缓缓取上清液上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；(2)(2)同时涂一张同时涂一张上清液片上清液片做好标记，自然干燥；做好标记，自然干燥；(3)(3)余下的余下的沉淀物沉淀物进行下一步骤。进行下一步骤。第12页/共18页7 7、用、用6ml 6ml 蔗糖一蔗糖一Tris-HC

8、I溶液悬浮沉淀物，以溶液悬浮沉淀物，以2500rpm2500rpm离心离心1515分钟弃上清，将分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片涂片，自然干燥。，自然干燥。8 8、将、将、涂片用涂片用l l甲苯胺兰（或亚甲基蓝）甲苯胺兰（或亚甲基蓝）染色后盖片即可观察。染色后盖片即可观察。第13页/共18页（二）高速离心分离提取线粒体1、将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17000g离心20分钟，弃上清，留取沉淀物。（本实验用12000rpm,非冷冻离心）2、加入蔗糖-Tris-Hcl 1ml，用吸

9、管吹打成悬液，以17000g离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml蔗糖-Tris-Hcl氯化钙溶液混匀成悬液(可用牙签)。第14页/共18页3、取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记、涂片)，各滴一滴1詹纳斯绿b染液染20分钟,盖片观察。4、油镜观察。第15页/共18页注意事项1、各步骤加入的溶液的量需根据离心管的大小自行调整。2、线粒体的染色必须先染色20分钟后盖盖片，以便充分氧化。3、本实验所有操作本应在低温下进行，但实验室的冷冻离心机损坏，用普通离心机离心，温度和转速都和实验步骤有差别。第16页/共18页实验报告方法：按照实际的操作记录结果：描述5张涂片镜下情况讨论：1、实际情况和理论预期是否符合？为什么？2、本实验步骤有哪些可以改进的地方？第17页/共18页感谢您的观看！第18页/共18页