实验六 细胞核和线粒体的荧光观察.ppt

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1、实验六细胞核和线粒体的荧光观察,一、实验目的,学习荧光显微镜的工作原理及使用方法了解荧光探针Rhodamine123和Hoechst33342与细胞成分的结合特性和光谱特性,二、实验原理,1.荧光显微镜,常用荧光探针介绍,Hoechst33342和Rhodamine123Ho.33342是一种亲脂性物质，能与DNA特异性结合的荧光探针，所以被大量用于活细胞的观察和定量的研究。荧光激发和发射特性分别为350nm和461nm。罗丹明123是一种亲脂性的阳离子荧光探针。用它来标记线粒体是由于线粒体的基质对于膜间隙具有负电荷，而罗丹明123具有正电荷，二者电性相吸。所以能较好地观察线粒体的形态变化。荧

2、光激发和发射特性为507nm和529nm。,三、仪器、材料与试剂,仪器荧光显微镜，倒置显微镜材料A549、WI-38pc-3、载玻片，盖片，滴管，滤纸试剂,PBS缓冲液pH7.4Ho.33342储存液:1mg/mL(溶于PBS)罗丹明123储存液:1mg/mL(溶于甲醇),四、实验步骤1.将肿瘤细胞和正常组织细胞培养到小盖玻片上2.配制Ho.33342和罗丹明123工作液:Ho.33342(10g/mL),罗丹明123(10g/mL)（溶于PBS缓冲液，pH7.4）3.将盖玻片上的细胞用PBS缓冲液轻轻漂洗2次4.在parafilm膜上分别滴加Ho.33342和罗丹明123工作液各10L，将盖

3、玻片上的细胞倒扣在parafilm膜上室温暗处孵育10min。5.在parafilm膜上加PBS缓冲液，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片,用PBS缓冲液轻轻漂洗2次。6.利用荧光显微镜观察细胞核、线粒体。,配制Ho.33342和罗丹明123工作液:Ho.33342(10g/mL),罗丹明123(10g/mL)（溶于PBS缓冲液，pH7.4）,将盖玻片上的细胞用PBS缓冲液轻轻漂洗2次，分别滴加Ho.33342和罗丹明123工作液各10L，室温暗处孵育10min,用PBS缓冲液轻轻漂洗2次，放在载玻片上制成的小室上,利用荧光显微镜观察细胞核、线粒体,实验步骤,将肿瘤细胞和正常组织细胞培养到小盖玻片上,至细胞进入对数生长期,思考题,1.荧光显微镜的工作原理，及使用时应注意的问题。2.细胞核的形态的变化与功能的关系,