流式分选原理.pptx

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1、流式分选的原理流式分选的影响因素分选流程及注意事项流式分选仪的原理及应用第1页/共33页流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术。流式细胞仪（FlowCytometer）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞术第2页/共33页分析型流式细胞仪VS分选型流式细胞仪CaliburAriaIII第3页/共33页Catchtuber（捕获管分选）唯一可选配分选装置的小型机。第4页/共33页电子偏转

2、的方式第5页/共33页流式分选的原理流式分选的影响因素分选流程及注意事项流式分选仪的原理及应用第6页/共33页完美的分选纯度纯度得率得率速度速度第7页/共33页高速分选的影响因素鞘液压力（Pressure)PSI振荡频率(DropFrequency)Hz喷嘴大小(Nozzle)m上样速度(SampleFlowRate)events/sec第8页/共33页分选最重要的问题GoodPurity分选后所得到的细胞是否是想要的？GoodRecovery分选后得到的细胞数量是否够用?GoodViability分选后有多少细胞是活的？第9页/共33页AriaIII高纯度高得率Sweetspot-液滴断点自

3、动监控Accudrop-液滴延迟自动调节32等分液滴分辨率，精确分选模式第10页/共33页Sweet Spot 液滴断点自动监测液滴断点监测窗口振幅自动调节，维持断点稳定阻塞报警，保护分选样本不受污染，实现分选时无人看管提高分选纯度和得率高得率分选,来自于液流稳定性第11页/共33页Accudrop 液滴延时自动控制专利的BDAccudrop技术能够自动地精确确定液滴延迟时间（细胞颗粒与激光正交的时间和细胞颗粒到达断点处的时间这两个时间的间隔）,保证最高的分选纯度及得率。全部自动完成精确计算，无需手动调节，并可实时监测。高纯度分选,来自于精确地充电第12页/共33页Purity and sor

4、t coincidencePurityisalsomaintainedbydetectingsortcoincidenceSort coincidenceSort coincidenceTwo Two or or more more particles particles are are too too close close together together to to be be separated separated in two individual dropsin two individual drops第13页/共33页AriaIII液滴32等分分析高纯度分选,来自于分析的精度Y

5、ieldMask第14页/共33页Tips:如何提升分选的纯度设置合适的分选模式选择合适的喷嘴孔径确保稳定的液流断点设置正确的dropdelay进行4路分选时，将纯度要求高的细胞分选设置在最外的2路减少样本的粘连正确的设门确保上样管路清洁后回测第15页/共33页Tips:如何提升回收率降低分选速度减少纯度要求正确的dropdelay正确的加电合适的收集管保护细胞活力正确的设门第16页/共33页AriaIII对细胞的保护高活性1.无菌处理Autoclean2.圆滑管路设计3.NG流动池低功率激光照射4.电子减速5.分选样本温控系统（4、25、37、42）影响细胞活性的因素：1.细胞本身状态2.细

6、胞受到的撞击3.激光照射4.细胞所处温度影响5.系统洁净程度第17页/共33页Tips:如何提升活力无菌环境的控制降低鞘液压力增大喷嘴孔径，脆弱细胞必须要用大孔径喷嘴包被样本收集管温度控制提升速度第18页/共33页流式分选的原理流式分选的影响因素分选流程及注意事项流式分选仪的原理及应用第19页/共33页鞘液必须使用盐离子缓冲溶液作为鞘液，通常是PBS，不建议使用生理盐水特别需要维持合适的pH值，通常为中性无菌分选时，需要高压灭菌鞘液（建议一直使用无菌鞘液）一般不加NaN3注意更换鞘液过滤器第20页/共33页合适样本类型细胞大小一般不超过喷嘴孔径1/5，绝不能超过1/3建议无菌样本，容易维持上样

7、针部分的无菌条件减少有高浓度PI的样本，以免残留在管路内，影响后续样本活性浓度可在107/ml一定要使用300-400目孔径过滤网过滤第21页/共33页分选前建议先进行预实验，调整实验设置，并且预估回收率，选择合适的样本量Ficoll分离过的PBMC使用PBS+1%humanABserum调整浓度到12x107PBMCs/mL第22页/共33页分选中设门去除粘连体细胞正确的分析对于需要后续培养或是对于内毒素特别敏感的细胞，建议完成无菌分选准备流程选择合适的分选精度选择合适的喷嘴孔径选择合适的上样速度以保证纯度和得率第23页/共33页第24页/共33页分选中温度的改变对细胞不利，控制上样舱和收集

8、的温度一些细胞需要特别的培养基或是血清来维持活性，加入不超过2%的血清pH值的变化同样会对细胞活性有影响，加入不超过25mM的HEPES到收集管中有助于维持pH样本的沉降容易导致速度的降低和细胞的聚集，导致堵塞，样本分选前过滤，可使用混匀功能或上样管过滤器，减少此类事件发生第25页/共33页收集收集管预先用humanABserum包被，然后加入0.4mLX-VIVO15培养液+10%humanABserum及0.2%acetylcysteine（用于培养），或是PBS+1%HumanABserum（仅用于回测）选择合适的收集管，并调节分选液流加电，使得分选液流尽可能打在培养基、PBS、血清的液

9、面上，而不是管壁收集后的细胞，用250g,10分钟进行离心，小心取上清，用于后续实验第26页/共33页提升活性减少样本收集前后的处理过程，去除不必要的离心和重悬减少剪切力效应，轻柔使用移液枪为减少细胞吸附到管壁，收集管使用聚丙烯材质，并用100%humanABserum包被分选中可暂停，轻柔混匀样本管和收集管，确保细胞悬浮第27页/共33页分选后分选后回测需要确保前后条件一致，确认进样针管路无残留，回测样本无酚红对于特别少的样本，容易显得杂质比较多尽量将分选后细胞的洗涤过程减少到1次，并且休整数小时后再进行培养或是后续处理第28页/共33页分选后回测第29页/共33页1、开液流和高压预热30分

10、2、定期更换鞘液滤器（一年一次）3、分选前检查Nozzle和O-ring4、及时清洗放置Nozzle的部位和NozzleLockingLever5、检查和更换快速接头o-ring6、使用PBS（不要使用生理盐水），PBS要过滤（0.2um）仪器的维护保养第30页/共33页7、选择合适的喷嘴和压力8、液流启动完，立刻用DI清洗ClosedNozzle，定期超声清洗ClosedNozzle9、更换PinchValve管道10、定期对上样架上润滑剂11、做CS&T质控12、定期整理实验实验数据（DataManage）仪器的维护保养第31页/共33页Thanks!BDB孔祥涛400-819-9900第32页/共33页感谢您的观看！第33页/共33页