融合蛋白.ppt

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1、融合蛋白及其应用融合蛋白及其应用 07生物技术生物技术主要内容主要内容n融合蛋白的概念融合蛋白的概念n融合蛋白技术概况融合蛋白技术概况n融合蛋白技术的临床应用融合蛋白技术的临床应用n常见的几种融合蛋白常见的几种融合蛋白一、融合蛋白的概念一、融合蛋白的概念 在基因工程迅速发展的基础上，在基因工程迅速发展的基础上，有目的地把两段或多段编码功能蛋白有目的地把两段或多段编码功能蛋白的基因连接在一起，进而表达所需蛋的基因连接在一起，进而表达所需蛋白，这种白，这种通过在人工条件下将两个或通过在人工条件下将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一多个基因的编码区首尾连接，由同一调控序列控制构成的基因调控序列控

2、制构成的基因表达后所得表达后所得的蛋白质产物称为的蛋白质产物称为融合蛋白融合蛋白(fusion protein，FP)。二、融合蛋白技术概况二、融合蛋白技术概况 融合蛋白技术是为获得大量融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和利用融合蛋白技术，可构建和表达具有表达具有多种功能的新型目的多种功能的新型目的蛋白。蛋白。（一）融合蛋白技术的特点（一）融合蛋白技术的特点n融合基因可在原核细胞融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌如大肠杆菌)也可在真核细胞中进行表达。原核表也可在真核细胞中进行

3、表达。原核表达系统的特点是达系统的特点是时程短，费用低，时程短，费用低，是是科研中的主要工具。其缺点是真核蛋科研中的主要工具。其缺点是真核蛋白表达白表达没有得到确切修饰没有得到确切修饰；大量蛋；大量蛋 白常常白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物沉淀成不溶性包涵体聚合物，需要需要复杂的变性和复性过程复杂的变性和复性过程；大量蛋；大量蛋白的白的分泌较困难分泌较困难。（一）融合蛋白技术的特点（一）融合蛋白技术的特点n真核表达系统的特点是真核表达系统的特点是蛋白翻蛋白翻译后加工机会多译后加工机会多，甚至可被改，甚至可被改造成人源型；真核细胞造成人源型；真核细胞易被转易被转染染，具有，具有遗传稳定性和可重复遗

4、传稳定性和可重复性性；产物可被分泌，；产物可被分泌，提纯简单，提纯简单，成本低成本低。（二）融合蛋白技术的内容（二）融合蛋白技术的内容构建融合蛋白的基本原则是，构建融合蛋白的基本原则是，将第一个将第一个蛋白的蛋白的终止密码子删除终止密码子删除，再接上，再接上带有终带有终止密码子的第二个蛋白基因止密码子的第二个蛋白基因，以实现两，以实现两个基因的个基因的共同表达共同表达。具体步骤有：。具体步骤有：1.进行目的基因的克隆：进行目的基因的克隆：根据基因序列互根据基因序列互补原则补原则，设计合适的引物序列，以，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用为模板，利用PCR技术扩增不同的技术扩增不同的目的

5、目的DNA片段。片段。（二）融合蛋白技术的内容（二）融合蛋白技术的内容2.在载体中进行重组：在载体中进行重组：通过限制通过限制内切酶将两个内切酶将两个DNA片段进行酶片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。重组质粒。（二）融合蛋白技术的内容（二）融合蛋白技术的内容3.将重组表达载体转染宿主细胞将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测并利用选择标志进行筛选及测序。序。4.融合基因的诱导表达及表达蛋融

6、合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化白的纯化。（三）融合蛋白技术的关键（三）融合蛋白技术的关键n在构建融合蛋白中，一个关键的问题在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的是两蛋白间的接头序列接头序列(Linker)，即，即连接肽连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要稳定性非常重要。如果接头序列太短，。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。本身就是新的抗原。（三）融合蛋白技术的关

7、键（三）融合蛋白技术的关键n 一般来说，一般来说，3-5 个氨基酸的个氨基酸的Linker 可可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。求。有人尝试在融合蛋白间加入一段有人尝试在融合蛋白间加入一段有有疏水性和一定伸展性的较长肽链疏水性和一定伸展性的较长肽链，如如(Gly4Ser1)，目的是将两者分开，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用，以缓解相互干扰作用，并获得了满意并获得了满意的结果。的结果。（三）融合蛋白技术的关键（三）融合蛋白技术的关键n 但具体涉及到每种蛋白时，需具体分但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋白时，应多选析。当我们构建融合蛋白时

8、，应多选择几种融合方式，择几种融合方式，从中优化出理想的从中优化出理想的连接方式。连接方式。n另外，大量研究表明另外，大量研究表明连接肽的柔性和连接肽的柔性和疏水性疏水性对不扰乱蛋白质的功能结构域对不扰乱蛋白质的功能结构域是十分重要的。是十分重要的。（三）融合蛋白技术的关键（三）融合蛋白技术的关键n遗憾的是，目前对于连接肽序列的设遗憾的是，目前对于连接肽序列的设计还没有可靠的选择标准。现在，大计还没有可靠的选择标准。现在，大多数连接肽序列的设计和选择仍主要多数连接肽序列的设计和选择仍主要依赖于直觉。尽管依赖于蛋白质的一依赖于直觉。尽管依赖于蛋白质的一级结构来预测其二级结构已经产生了级结构来预测

9、其二级结构已经产生了重大的进步，但是我们对于重大的进步，但是我们对于序列和结序列和结构之间的关系构之间的关系的了解还是很有限的。的了解还是很有限的。三、融合蛋白技术的临床三、融合蛋白技术的临床 应用应用lDNA疫苗疫苗 l双功能酶（多功能酶）双功能酶（多功能酶）l定向药物定向药物 l溶栓剂溶栓剂l抗菌肽抗菌肽 （一）（一）DNA疫苗疫苗 目前，疫苗已经经历了三代：目前，疫苗已经经历了三代：第一代疫苗是用第一代疫苗是用减毒或杀死的病原体减毒或杀死的病原体来激来激活机体免疫系统；活机体免疫系统；第二代疫苗是用第二代疫苗是用生物技术和重组生物技术和重组DNA技术技术研制的组分疫苗注射机体诱导免疫应答

10、；研制的组分疫苗注射机体诱导免疫应答；第三代疫苗是直接注射第三代疫苗是直接注射基因重组的抗原基基因重组的抗原基 因因来激活人体免疫系统，即来激活人体免疫系统，即DNA疫苗。疫苗。（一）（一）DNA疫苗疫苗DNA疫苗与传统疫苗相比有着疫苗与传统疫苗相比有着明显的优势，如易于生产，稳明显的优势，如易于生产，稳定性强，成本低廉等，并可同定性强，成本低廉等，并可同时时诱导体液与细胞免疫应答诱导体液与细胞免疫应答。（一）（一）DNA疫苗疫苗DNA疫苗的免疫方法是将带疫苗的免疫方法是将带有目的基因并能在真核细胞有目的基因并能在真核细胞中表达的中表达的细菌质粒细菌质粒直接导入直接导入动物体内，通过在体内表达

11、动物体内，通过在体内表达目的蛋白以引起机体对该蛋目的蛋白以引起机体对该蛋白的免疫应答。白的免疫应答。（一）（一）DNA疫苗疫苗目前利用基因工程成功制成的目前利用基因工程成功制成的多价多价重组抗体融合蛋白重组抗体融合蛋白 CYF196(国内尚国内尚未上市未上市)就是一种就是一种DNA疫苗，疫苗，它能它能有效防治下呼吸道感染和哮喘。因有效防治下呼吸道感染和哮喘。因为为CYF196对病毒的主要受体对病毒的主要受体-位于位于呼吸道上皮中的细胞间黏附分子呼吸道上皮中的细胞间黏附分子有有高度亲和力，对鼻病毒感染有较强高度亲和力，对鼻病毒感染有较强 的防御功能。的防御功能。（二）双功能酶（多功能酶）（二）双

12、功能酶（多功能酶）以往研究发现以往研究发现，在利用基因在利用基因融合所构建的大的酶分子中，如果融合所构建的大的酶分子中，如果用以构成融合蛋白的各个酶分子的用以构成融合蛋白的各个酶分子的整个编码序列均保留于新的酶分子整个编码序列均保留于新的酶分子中，则融合蛋白一般均保留所构成中，则融合蛋白一般均保留所构成的酶分子各自的酶活性。的酶分子各自的酶活性。（二）双功能酶（多功能酶）（二）双功能酶（多功能酶）并且发现在这些新构建的融合蛋并且发现在这些新构建的融合蛋白中，蛋白的正确折叠以及各个酶白中，蛋白的正确折叠以及各个酶的活性部位均未受到影响，与单个的活性部位均未受到影响，与单个酶相比，融合蛋白的酶的比

13、活力为酶相比，融合蛋白的酶的比活力为50%-100%，对于催化连续反应的，对于催化连续反应的两种或几种酶，两种或几种酶，利用基因融合的方利用基因融合的方法构成的融合蛋白可产生法构成的融合蛋白可产生“邻近效邻近效应应”（proximity effect）。）。（二）双功能酶（多功能酶）（二）双功能酶（多功能酶）l目前研究发现，目前研究发现，-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-半半乳糖脱氢酶融合蛋白乳糖脱氢酶融合蛋白在一定条件下，在一定条件下，其偶联反应产生其偶联反应产生 NADH 的速度是的速度是同时加入这两种酶的反应速度的两同时加入这两种酶的反应速度的两倍以上。同时过渡态时间缩短近四倍以上。同时过渡态时间

14、缩短近四倍。倍。（三）定向药物（三）定向药物n定向药物一般由两部分组成：一部定向药物一般由两部分组成：一部分是分是药物药物；另一部分是可以与病灶；另一部分是可以与病灶特异性结合的特异性结合的配基配基。通过融合蛋白。通过融合蛋白技术将这两部分融合在一起，技术将这两部分融合在一起，即即可构成可构成一个具有独特构象与功能的一个具有独特构象与功能的蛋白质。蛋白质。（三）定向药物（三）定向药物n特点：它可以特异性地与靶细胞或特点：它可以特异性地与靶细胞或致病因子结合，并把药物引导至病致病因子结合，并把药物引导至病灶处，从而大大提高药物的效力。灶处，从而大大提高药物的效力。可以可以选择性地杀伤相应的抗原相

15、关选择性地杀伤相应的抗原相关细胞或受体相关细胞细胞或受体相关细胞，对其他无关，对其他无关细胞影响较少或无影响。细胞影响较少或无影响。（三）定向药物（三）定向药物n配基常是肿瘤特异性抗体、细配基常是肿瘤特异性抗体、细胞因子或激素等胞因子或激素等导向物质导向物质，药，药物常是物常是毒性分子毒性分子（如动植物毒（如动植物毒素、素、放疗、化疗药物或细菌毒放疗、化疗药物或细菌毒素等）。素等）。（四）溶栓剂（四）溶栓剂n新型溶栓剂的要求是具有多种功能，新型溶栓剂的要求是具有多种功能，既有较高的既有较高的溶栓活性溶栓活性，又有较强的，又有较强的纤维蛋白的亲和性或抑制血栓的功纤维蛋白的亲和性或抑制血栓的功能能

16、，从而使溶栓剂具有较高的纤维，从而使溶栓剂具有较高的纤维蛋白专一性，减少出血副作用，降蛋白专一性，减少出血副作用，降低溶栓药物使用后再栓塞形成的可低溶栓药物使用后再栓塞形成的可能性。能性。（四）溶栓剂（四）溶栓剂 凝凝血血酶酶在在血血小小板板激激活活后后促促进进纤纤维维蛋蛋白白酶酶原原转转化化为为纤纤维维蛋蛋白白，在在凝凝血血过过程程中中起起主主要要作作用用，在在动动物物模模型型和和人人体体中中，肝肝素素是是凝凝血血酶酶间间接接抑抑制制剂剂，水水蛭蛭素素则则是是 其其 直直 接接 抑抑 制制 剂剂。单单 克克 隆隆 抗抗 体体mAb59D能能靶靶向向血血块块，mAb59D8与与纤纤溶溶酶酶原原

17、活活化化因因子子偶偶合合能能达达到到靶靶向向治治疗疗和和有有效效溶溶栓栓的的目目的的。（四）溶栓剂（四）溶栓剂n但两者化学结合不仅产量低但两者化学结合不仅产量低，而且而且在生产过程中部分损失了在生产过程中部分损失了水蛭素的水蛭素的溶栓活性溶栓活性。利用基因融合技术，利用基因融合技术，把水蛭素把水蛭素和和mAb59D8的纤维蛋白的纤维蛋白原片段融合，融合蛋白在稳态时无原片段融合，融合蛋白在稳态时无作用，只有用凝血酶原激酶作用，只有用凝血酶原激酶(Ax)对它进行切割激活后，才有活性。对它进行切割激活后，才有活性。（四）溶栓剂（四）溶栓剂n利用分子克隆技术，利用分子克隆技术，这种融合这种融合蛋白能成

18、功蛋白能成功 转录并高效表达于转录并高效表达于59D8杂交瘤细胞系，这种策略杂交瘤细胞系，这种策略结合了结合了靶向溶栓靶向溶栓和和 Ax因子激活因子激活，有效地在血栓处发挥作用，对有效地在血栓处发挥作用，对全身的副作用很小。全身的副作用很小。（五）抗菌肽（五）抗菌肽n肽类抗生素又名抗菌肽，机体天然肽类抗生素又名抗菌肽，机体天然产生的抗菌肽由于其对耐药菌的强产生的抗菌肽由于其对耐药菌的强大抗菌作用而受到人们关注。它广大抗菌作用而受到人们关注。它广泛存在于动植物体内，是由生物体泛存在于动植物体内，是由生物体特定基因编码的特定基因编码的一类阳离子小分子一类阳离子小分子多肽，具有广谱抗菌活性，是机体多

19、肽，具有广谱抗菌活性，是机体天然免疫的重要组成部分。天然免疫的重要组成部分。（五）抗菌肽（五）抗菌肽n研究结果表明，抗菌肽可以在亚研究结果表明，抗菌肽可以在亚毒性浓度下抑制毒性浓度下抑制 HIV-1的基因的基因表达，表达，减少减少 HIV-1的增殖。而的增殖。而人源溶菌酶除了具有一般溶菌酶人源溶菌酶除了具有一般溶菌酶的抗菌活性外，的抗菌活性外，也具有抗病毒也具有抗病毒的特性，的特性，已有研究证实人源溶已有研究证实人源溶菌酶具有抗菌酶具有抗HIV-1的作用。的作用。（五）抗菌肽（五）抗菌肽n目前已有人构建了目前已有人构建了抗菌肽抗菌肽B和人和人溶菌酶的融合蛋白表达载体溶菌酶的融合蛋白表达载体。并

20、。并成功表达出了具有抗菌和抗病毒成功表达出了具有抗菌和抗病毒双重活性的重组蛋白。双重活性的重组蛋白。四、常见的几种融合蛋白四、常见的几种融合蛋白 （一）免疫球蛋白（一）免疫球蛋白（IgIg）融合）融合 蛋白蛋白 （二）（二）甲状旁腺激素甲状旁腺激素（PTH）融合蛋白融合蛋白 （三）细胞因子重组融合蛋白（三）细胞因子重组融合蛋白（一）免疫球蛋白（一）免疫球蛋白（IgIg）融合蛋白）融合蛋白wIgIg融合蛋白是指在基因水平将目的融合蛋白是指在基因水平将目的基因同基因同IgIg部分片段基因相连，并在部分片段基因相连，并在真核或原核细胞中表达出的具有上真核或原核细胞中表达出的具有上述两部分结构域的重组

21、蛋白。据目述两部分结构域的重组蛋白。据目的蛋白与的蛋白与IgIg不同片断相连，可将其不同片断相连，可将其分为二大类分为二大类：一类为一类为Fab(Fv)融合融合蛋白；蛋白；另一类为另一类为 Fc融合蛋白。融合蛋白。1、Fab(Fv)融合蛋融合蛋wFab(Fv)融合蛋白主要是将融合蛋白主要是将Fab(Fv)段与其他生物活性蛋白结合，利用段与其他生物活性蛋白结合，利用抗体对抗原的特异识别功能将活性抗体对抗原的特异识别功能将活性蛋白导向特定部位蛋白导向特定部位。使活性蛋白在。使活性蛋白在特定部位发挥生物作用。常见的与特定部位发挥生物作用。常见的与 Fab融合的蛋白有毒素、细胞因子、融合的蛋白有毒素、

22、细胞因子、受体、酶等。受体、酶等。肿瘤靶向免疫治疗肿瘤靶向免疫治疗w将一些生物活性蛋白将一些生物活性蛋白(如毒素、如毒素、细胞因子等细胞因子等)与抗肿瘤抗体的与抗肿瘤抗体的 Fab段融合，段融合，利用抗体对肿瘤抗利用抗体对肿瘤抗原的识别作用而进行原的识别作用而进行靶向免疫治靶向免疫治疗。疗。肿瘤靶向免疫治疗肿瘤靶向免疫治疗w如如Forsberg G等利用抗癌胚抗原等利用抗癌胚抗原(CEA)抗体的抗体的Fab段与葡萄球菌肠毒段与葡萄球菌肠毒素素(SEA)融合组成融合组成 一个一个超抗原超抗原，融融合超抗原可导向肿瘤细胞并激活合超抗原可导向肿瘤细胞并激活 T细胞杀死表达有癌胚抗原肿瘤细胞。细胞杀死

23、表达有癌胚抗原肿瘤细胞。肿瘤靶向免疫治疗肿瘤靶向免疫治疗w而将而将T细胞共刺激分子细胞共刺激分子B7与抗瘤抗与抗瘤抗体结合就可将体结合就可将B7导向肿瘤细胞。导向肿瘤细胞。B7-抗瘤抗体，一方面抗瘤抗体，一方面与肿瘤细胞表与肿瘤细胞表面抗原结合面抗原结合，一方面，一方面提供共刺激信提供共刺激信号给号给T T细胞能有效触发肿瘤特异细胞细胞能有效触发肿瘤特异细胞毒毒T T细胞反应细胞反应。2、Fc融合蛋白融合蛋白wFc融合蛋白主要是将融合蛋白主要是将生物活性蛋白生物活性蛋白与与 IgIg的绞链区及的绞链区及 CH2、CH3区结合区结合。与与 Fc段融合的蛋白种类很多，其作段融合的蛋白种类很多，其作

24、用也各不相同，归纳起来有如下几用也各不相同，归纳起来有如下几方面：方面：（1）抗病毒感染）抗病毒感染l目前发现使用目前发现使用DNA疫苗加上疫苗加上IL-2-IgIg融合蛋白融合蛋白注射到实验用的恒河猴注射到实验用的恒河猴，然后高剂量静脉内给恒河猴注然后高剂量静脉内给恒河猴注射射 SHIV病毒。虽然它们不能阻止病毒。虽然它们不能阻止猴被猴被 SHIV病毒感染，病毒感染，但确实可控但确实可控制病毒血症到几乎测不到的水平，制病毒血症到几乎测不到的水平，并并预防免疫缺陷和临床症状预防免疫缺陷和临床症状。（1）抗病毒感染）抗病毒感染l目前目前IL-2已用于临床治疗已用于临床治疗HIV和癌和癌症，但由于

25、症，但由于 IL-2在活体内在活体内半衰期短，半衰期短，有毒性作用及成本高有毒性作用及成本高，其临床治疗，其临床治疗作用受限。而用作用受限。而用 IL2-IgIg融合蛋白，融合蛋白，它有它有 IL-2的免疫刺激活性且半衰期的免疫刺激活性且半衰期长长，用它注入健康恒河猴可诱导用它注入健康恒河猴可诱导T T细胞数目增加并表达细胞数目增加并表达CD25。（2）治疗痛觉过敏）治疗痛觉过敏lEtanercept，一个重组一个重组 TNFR-Fc融融合蛋白，合蛋白，可竞争性抑制可竞争性抑制TNF，它已成，它已成功用于治疗功用于治疗类风湿性关节炎类风湿性关节炎的病人，的病人，能减少疼痛和炎症，在神经损伤后，

26、能减少疼痛和炎症，在神经损伤后，由于局部产生前炎性细胞因子对疼痛由于局部产生前炎性细胞因子对疼痛产生起一产生起一 个主要作用。给坐骨神经慢个主要作用。给坐骨神经慢性压缩性损伤的鼠注射性压缩性损伤的鼠注射 Etanercept 可可减少热痛觉过敏和机械性异常性疼痛减少热痛觉过敏和机械性异常性疼痛。（2）治疗痛觉过敏）治疗痛觉过敏l实验诱导猪神经根损伤，同时给猪实验诱导猪神经根损伤，同时给猪 注射注射 Etanercept 7天后显示天后显示 Etanercept 能能预防神经传导速度预防神经传导速度的减低的减低，限制神经纤维损伤，限制神经纤维损伤，防防止毛细血管内血栓和神经内水肿形止毛细血管内血

27、栓和神经内水肿形成成。预示。预示 Etanercept 可用于治疗可用于治疗椎间盘突出和坐骨神经痛。椎间盘突出和坐骨神经痛。（3）类风湿性关节炎的治疗）类风湿性关节炎的治疗l类风湿性关节炎类风湿性关节炎(RA)是一个系统是一个系统性疾病，性疾病，以关节滑膜慢性炎症反以关节滑膜慢性炎症反应为特征并有软骨变性和关节旁骨应为特征并有软骨变性和关节旁骨的侵蚀的侵蚀。（3）类风湿性关节炎的治疗）类风湿性关节炎的治疗l已知已知TNF与与RA的发病机理有很大关系，的发病机理有很大关系，许多实验证实用人可溶性重组许多实验证实用人可溶性重组TNF受受体与体与 IgIgFc段蛋白融合段蛋白融合可完全竞争性抑可完全

28、竞争性抑制制TNF结合到细胞表面受体，结合到细胞表面受体，使使TNF无生物活性无生物活性。给病人注射。给病人注射 Etanercept 可减少关节肿胀及炎症可减少关节肿胀及炎症，减少关节腔狭窄。临床上已用于治疗减少关节腔狭窄。临床上已用于治疗类风湿性关节炎。类风湿性关节炎。（4）用于其他科学研究）用于其他科学研究l融合蛋白还可以作为一种研究工具应融合蛋白还可以作为一种研究工具应用用 于许多方面的研究，如人表皮生长于许多方面的研究，如人表皮生长因子受体因子受体2蛋白蛋白(HER2)向上调节血管促向上调节血管促白细胞生成素白细胞生成素(Ang-2)的表达的表达，而利而利用酪氨酸蛋白激酶受体用酪氨酸

29、蛋白激酶受体-2-Fc(Tie-2/Fc)融合蛋白将减少肿瘤细胞释放血融合蛋白将减少肿瘤细胞释放血管促白细胞生成素，这样就可研究管促白细胞生成素，这样就可研究 HER2对微血管的折除对微血管的折除(dismantle)作作用。用。（二）（二）PTH融合蛋白融合蛋白n甲状旁腺激素甲状旁腺激素(Parathyroid Hormone，PTH)是由是由甲状旁腺主细胞合成和分泌的一甲状旁腺主细胞合成和分泌的一种单链多肽激素种单链多肽激素，成熟，成熟PTH含含84个氨基酸个氨基酸残基，残基，分子量约为分子量约为 9500，是人体内调节钙，是人体内调节钙磷代谢及骨转换的最为重要的激素之一。磷代谢及骨转换的

30、最为重要的激素之一。它主要通过作用于靶细胞膜上腺苷酸环化它主要通过作用于靶细胞膜上腺苷酸环化酶系统，酶系统，增加胞浆内增加胞浆内cAMP及焦磷酸盐及焦磷酸盐(PPi)的水平来发挥作用。的水平来发挥作用。n蛋白类药物的分子量若蛋白类药物的分子量若小于小于20kD在代谢过在代谢过程中易被程中易被 肾小球滤过，且在体内的半衰期肾小球滤过，且在体内的半衰期较短，皮下给药或肌肉注射的半衰期一般较短，皮下给药或肌肉注射的半衰期一般在在12h左右。因此，长效蛋白药物的研制左右。因此，长效蛋白药物的研制 已成为对第一代基因工程产品进行二次开已成为对第一代基因工程产品进行二次开发的一个重要方向，而发的一个重要方

31、向，而增加分子量增加分子量则是一则是一个通用的策略。人们已经采用多种方法来个通用的策略。人们已经采用多种方法来 对对PTH 的性质进行改进，的性质进行改进，以在保留它的活以在保留它的活性性 的同时提高半衰期。的同时提高半衰期。其中包括构建突变其中包括构建突变体、体、化学修饰以及基因融合等，而化学修饰以及基因融合等，而基因融基因融合技术合技术为最突出的。为最突出的。n常用的融合蛋白的载体有常用的融合蛋白的载体有人血清白人血清白蛋白蛋白(Huma serum albumin，HSA)融合蛋白融合蛋白、-半乳糖苷酶融半乳糖苷酶融合蛋白、合蛋白、谷胱甘肽谷胱甘肽 S-转移酶转移酶(GST)融合蛋白以及

32、硫氧还蛋白融合蛋白以及硫氧还蛋白(Trx)融融合蛋白等。合蛋白等。而人血清白蛋白而人血清白蛋白(HSA)则由于本身特殊的优点，则由于本身特殊的优点，更更适合于充当长效融合蛋白类适合于充当长效融合蛋白类 药物药物的融合载体。的融合载体。HSA是包含是包含585个氨基酸残基的个氨基酸残基的单链无糖基化的球形蛋白质单链无糖基化的球形蛋白质，分子分子量量65kD。它是。它是人血浆中含量最高的人血浆中含量最高的单一蛋白质单一蛋白质(达达40g/L)，在体内有在体内有维持血液渗透压，维持血液渗透压，运输营养和其它运输营养和其它重要生物物质的作用。重要生物物质的作用。HSA本身是本身是许多许多内源因子和外源

33、药物内源因子和外源药物的载体。的载体。药物和血清白蛋白结合后。可以减药物和血清白蛋白结合后。可以减少其生物利用度，少其生物利用度，增加在体内的半增加在体内的半衰期至衰期至19d之久。之久。人血清白蛋白融合技术具有明显人血清白蛋白融合技术具有明显 的优点，包括：的优点，包括：HSA与目标蛋白在与目标蛋白在胞内经蛋白翻译系统通过肽键连接，胞内经蛋白翻译系统通过肽键连接，不需额外的体外处理不需额外的体外处理；HSA表达水表达水平较高，平较高，融合后可以提高融合后可以提高目的蛋白目的蛋白的表达水平的表达水平；HSA是一个稳定的是一个稳定的“惰性惰性”蛋白，蛋白，融合后可以提融合后可以提高目的高目的蛋白

34、的稳定性蛋白的稳定性；HAS融合蛋白具有融合蛋白具有比比PEG修饰的蛋白药物更长的半衰修饰的蛋白药物更长的半衰期期。（三）细胞因子重组融合蛋白（三）细胞因子重组融合蛋白v细胞因子重组融合蛋白是细胞因子重组融合蛋白是一类利用基因一类利用基因工程的方法将编码细胞因子和其他有特工程的方法将编码细胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列连接并表达定功能的蛋白分子基因序列连接并表达相应蛋白质融合产物相应蛋白质融合产物。其结构特点为将。其结构特点为将细胞因子功能活性域与其他分子的活性细胞因子功能活性域与其他分子的活性域融合，各组分可发挥协同作用，使融域融合，各组分可发挥协同作用，使融合蛋白的生物学活性较各

35、单体大大增强。合蛋白的生物学活性较各单体大大增强。按生物学功能的不同可分为：细胞按生物学功能的不同可分为：细胞因子与抗体的融合蛋白、因子与抗体的融合蛋白、细胞因子与毒细胞因子与毒素的融合蛋白素的融合蛋白、不同细胞因子的融合蛋、不同细胞因子的融合蛋白、白、细胞因子与细胞因子受体的融合蛋细胞因子与细胞因子受体的融合蛋白白以及以及细胞因子与其他分子的融合蛋白细胞因子与其他分子的融合蛋白。这些兼具特异这些兼具特异 性与高效性的新型重组融性与高效性的新型重组融合蛋白有些已走向临床，合蛋白有些已走向临床，在抗肿瘤、在抗肿瘤、抗风湿病、抗抗风湿病、抗 HIV感染等领域发挥作用，感染等领域发挥作用，为人类疾病

36、的治疗提供新的手段。为人类疾病的治疗提供新的手段。1、细胞因子与毒素的融合蛋白、细胞因子与毒素的融合蛋白v在一些肿瘤细胞表面存在许多细胞在一些肿瘤细胞表面存在许多细胞因子受体，因子受体，可利用细胞因子作为靶可利用细胞因子作为靶向载体将细胞毒素运送到肿瘤微环向载体将细胞毒素运送到肿瘤微环境以杀伤肿瘤细胞。境以杀伤肿瘤细胞。白喉毒素与细白喉毒素与细胞因子的重组融合蛋白胞因子的重组融合蛋白便是这样一便是这样一类能直接杀伤靶细胞的免疫制剂。类能直接杀伤靶细胞的免疫制剂。v体外试验表明，白喉毒素体外试验表明，白喉毒素-IL-2的融合的融合蛋白蛋白(DAB389IL-2)对表达高亲和力对表达高亲和力IL-

37、2受体的细胞株起毒性作用，而缺乏完受体的细胞株起毒性作用，而缺乏完整的高亲和力受体的细胞株整的高亲和力受体的细胞株(有有p55亚亚单位而无单位而无p75亚单位亚单位)则对该融合毒素则对该融合毒素相对耐受。细胞结合该融合毒素后，相对耐受。细胞结合该融合毒素后，可观察到类似于可观察到类似于IL-2刺激之后的情况，刺激之后的情况，即即IL-2、IL-2受体的受体的mRNA的表达增高，的表达增高，蛋白合成在蛋白合成在4-6h内开始受抑制，内开始受抑制，继发继发的凋亡则在的凋亡则在40-72h内发生。内发生。vSaleh等报道等报道 DAB389IL-2在皮肤在皮肤T细细胞淋巴瘤胞淋巴瘤(cutaneo

38、us T cell lymphoma，CTCL)1期临床试验中期临床试验中单独使用显示出显著的临床治疗效单独使用显示出显著的临床治疗效果。果。DAB389IL-2已成为美国食品与已成为美国食品与药品管理局药品管理局(FDA)核准的临床治疗核准的临床治疗药物。药物。2、细胞因子与细胞因、细胞因子与细胞因 子受体的融合蛋白子受体的融合蛋白v通过将在体内发挥作用时相互依赖或者通过将在体内发挥作用时相互依赖或者所具有的协同作用细胞因子与细胞因子所具有的协同作用细胞因子与细胞因子受体基因重组，受体基因重组，可大大促进其生物学活可大大促进其生物学活性的发挥。性的发挥。IL-6在肝细胞的增殖中起着在肝细胞的

39、增殖中起着增强作用。增强作用。IL-6和和IL-6R(gp80(gp80)的结合的结合使其易于和另一个受体使其易于和另一个受体IL-6R(gpl30)结合。结合。vFischer 等用基因重组的方法构建了一等用基因重组的方法构建了一种种IL-6-slL-6R融合蛋白融合蛋白 hyper-IL-6。在在gpl30 细胞上，细胞上，该融合蛋白表现出了该融合蛋白表现出了完全的生物学活性，完全的生物学活性，而所需浓度仅为非而所需浓度仅为非融合形式的融合形式的 IL-6和和 slL-6 R的的100至至1000分之一分之一，因而被用于在体外有效因而被用于在体外有效的扩增造血祖细胞，且该作用具有剂量的扩增

40、造血祖细胞，且该作用具有剂量依赖关系。进一步的大鼠体内试验表明，依赖关系。进一步的大鼠体内试验表明，hyper-IL-6可逆转亚致死性或致死性肝可逆转亚致死性或致死性肝毒性损伤，毒性损伤，且此作用不可被且此作用不可被 IL-6替代替代。3、细胞因子与其他、细胞因子与其他 分子的融合蛋白分子的融合蛋白v细胞因子还被设计与其他生物活性分子细胞因子还被设计与其他生物活性分子如某些肿瘤相如某些肿瘤相 关抗原，关抗原，信号转导途径信号转导途径中的相关分子等融合。中的相关分子等融合。vAqeilan等报道了一个新的人融合蛋白等报道了一个新的人融合蛋白I L-2-Bax用于靶向治疗。用于靶向治疗。Bax属于

41、属于Bcl-2蛋白家族，为促凋亡因子。蛋白家族，为促凋亡因子。v诱导诱导Bax 表达便可表达便可介导细胞凋亡而介导细胞凋亡而不需要附加的细胞死亡刺激信号不需要附加的细胞死亡刺激信号，且通过凋亡途径杀伤靶细胞可使组且通过凋亡途径杀伤靶细胞可使组织损伤和全身性反应降至最低。研织损伤和全身性反应降至最低。研究表明，究表明，该融合蛋白介导的靶细胞该融合蛋白介导的靶细胞凋亡呈凋亡呈剂量依赖关系剂量依赖关系。靶向性细胞。靶向性细胞因子和凋亡蛋白融合产物在体内及因子和凋亡蛋白融合产物在体内及 体外可选择性杀伤特定类型细胞，体外可选择性杀伤特定类型细胞，开创了疾病靶向治疗新视野。开创了疾病靶向治疗新视野。v目前，目前，细胞因子融舍蛋白在肿瘤治细胞因子融舍蛋白在肿瘤治疗疗 研究研究 中取得了很大进展，中取得了很大进展，已成已成为细胞因子研究中的一个热点领域。为细胞因子研究中的一个热点领域。由于机体很多功能是由细胞因子共由于机体很多功能是由细胞因子共 同作用、相互协调完成的。因此，同作用、相互协调完成的。因此，双因子的协同作用双因子的协同作用 能够实现细胞因能够实现细胞因子与其它功能分子之间作用子与其它功能分子之间作用 的优化，的优化，为肿瘤治疗提供了新的途径为肿瘤治疗提供了新的途径。THANK YOU