《融合蛋白表达系统》PPT课件.ppt

《《融合蛋白表达系统》PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《融合蛋白表达系统》PPT课件.ppt（17页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、第二章第二章 基因工程的工具酶与载体基因工程的工具酶与载体第三节第三节 表达载体表达载体二、融合蛋白表达系统二、融合蛋白表达系统表达载体的基本结构表达载体的基本结构 表达蛋白的识别？表达蛋白的识别？表达蛋白的分离？表达蛋白的分离？表达蛋白的活性？表达蛋白的活性？蛋白表达的高效性？蛋白表达的高效性？蛋白表达的可控性？蛋白表达的可控性？1 1、融合蛋白表达系统的概念、融合蛋白表达系统的概念v蛋白质融合表达是指外源基因与载体已有蛋白质融合表达是指外源基因与载体已有的担体蛋白的编码基因拼接在一起，并作的担体蛋白的编码基因拼接在一起，并作为一个新的开放阅读框进行表达。为一个新的开放阅读框进行表达。目的基

2、因目的基因目的基因目的基因启动子启动子启动子启动子担体基因担体基因担体基因担体基因接头接头接头接头MetMetStopStop载体载体-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（LacZLacZ）容易识别、免疫亲和分离容易识别、免疫亲和分离绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白（GFPGFP）容易识别容易识别谷胱甘肽转移酶（谷胱甘肽转移酶（GSTGST）免疫亲和分离、维持良好构象免疫亲和分离、维持良好构象金黄色葡萄球菌蛋白金黄色葡萄球菌蛋白A A（SAPASAPA）免疫亲和分离免疫亲和分离泛素蛋白（泛素蛋白（UbiUbi）维持良好空间构象维持良好空间构象硫氧化还原蛋白（硫氧化还原蛋白（TrxATrxA）维持良好空间构象维持

3、良好空间构象2 2、用于融合蛋白构建的高表达的担体蛋白、用于融合蛋白构建的高表达的担体蛋白MCSpUC18/19载体载体Lac Z 目的蛋白目的蛋白3 3、融融合合蛋蛋白白表表达达载载体体T7T7载体系统载体系统HisHis标签标签+目的蛋白目的蛋白谷胱甘肽谷胱甘肽S S转移酶（转移酶（GSTGST）融合蛋白表达系统）融合蛋白表达系统ATG GST目的蛋白目的蛋白加强加强GFPGFP表达表达的哺乳动物的哺乳动物细胞融合蛋细胞融合蛋白表达质粒白表达质粒 目的蛋白目的蛋白 EGFPGFPGFP融合蛋白的表达融合蛋白的表达DNA T4连接酶连接酶Sac I 6100bpPst I 6100bpSac

4、 I+Pst I 4700+1400bpCOS7细胞系细胞系目的基因目的基因ZNF325ZNF325MCS目的基因目的基因ZNF325ZNF325EGFPNN蛋白内切酶蛋白内切酶蛋白内切酶蛋白内切酶切割位点切割位点切割位点切割位点梭菌蛋白酶梭菌蛋白酶梭菌蛋白酶梭菌蛋白酶 Arg-CArg-C葡萄球菌蛋白酶葡萄球菌蛋白酶葡萄球菌蛋白酶葡萄球菌蛋白酶 Glu-CGlu-C假单孢菌蛋白酶假单孢菌蛋白酶假单孢菌蛋白酶假单孢菌蛋白酶 Lys-CLys-C猪胰蛋白酶猪胰蛋白酶猪胰蛋白酶猪胰蛋白酶 Arg-CArg-C Lys-C Lys-CArg CArg CNNCC担体蛋白担体蛋白担体蛋白担体蛋白目的蛋

5、白目的蛋白目的蛋白目的蛋白化学断裂法化学断裂法：溴化氰（溴化氰（CNBrCNBr）甲硫氨酸残基甲硫氨酸残基酶促裂解法酶促裂解法单残基位点与多单残基位点与多残基位点断裂法残基位点断裂法 4 4、融合蛋白中目的蛋白的分离和回收、融合蛋白中目的蛋白的分离和回收启动子启动子启动子启动子担体基因担体基因担体基因担体基因接头接头接头接头目的基因目的基因目的基因目的基因MetMetStopStop Ile-Glu-gly-ArgIle-Glu-gly-Arg凝血因子凝血因子凝血因子凝血因子XaXaXaXa的识别、作用序列的识别、作用序列的识别、作用序列的识别、作用序列Ile-Glu-gly-ArgIle-G

6、lu-gly-Arg表达表达表达表达亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析酶解回收酶解回收酶解回收酶解回收酶促裂解法：多残基位点酶促裂解法：多残基位点酶促裂解法：多残基位点酶促裂解法：多残基位点4 4、融合蛋白中目的蛋白的分离和回收、融合蛋白中目的蛋白的分离和回收 表达率高，稳定性好；表达率高，稳定性好；通过亲和层析通过亲和层析容易对担体蛋白进行分离和纯化容易对担体蛋白进行分离和纯化；可以帮助目的蛋白形成正确的空间结构可以帮助目的蛋白形成正确的空间结构。容易将担体蛋白从目的蛋白中裂解出来容易将担体蛋白从目的蛋白中裂解出来。5 5、融合蛋白表达的优点、融合蛋白表达的优点6 6、构建融合蛋白表达载体的注意事项、构建融合蛋白表达载体的注意事项目的蛋白目的蛋白的方向的方向终止密码终止密码子问题子问题目的基因目的基因移码问题移码问题ATGEcoR I P1引物P2引物 BamH ITGA ACG终止密码子问题终止密码子问题融合蛋白表达载体移码问题融合蛋白表达载体移码问题 ATG CCA GAC GGG CCC AAT ACCTAA 目的基因酶切末端加酶切末端加ATGATG之间的碱基序列必须是之间的碱基序列必须是3 3的倍数！的倍数！融合蛋白在体表达融合蛋白在体表达-IRES-IRES序列的引入序列的引入转基因斑马鱼转基因斑马鱼的载体的载体 转基因果蝇的载体转基因果蝇的载体