MTT实验操作流程1.pdf

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1、MTTMTT 实验标准操作流程实验标准操作流程1.原理活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶标仪在 570nm 波长处测定其光吸收值,在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(即 OD 值),来判断活细胞数量,OD 值越大,细胞活性越强(如果是测药物毒性,则表示药物毒性越小)。2.试剂及耗材CO2 细胞培养箱、生物安全柜、倒置显微镜、低速离心机、酶标仪、8 道排枪、培养基胎牛血清、MTT、DMSO、96 孔细胞培养板、胰酶、

2、血细胞计数板3.注意事项MTT 溶液的配制,通常 MTT 配成的终浓度为 5mg/ml,须用 PBS 或生理盐水做溶剂。MTT 一般最好现用现配,0.22m 过滤后 4避光保存两周内,或配制成 5mg/ml保存在-20长期保存,避免反复冻融,小剂量分装,用避光袋或锡箔纸包住避光以免分解,当 MTT 变为灰绿色时不能再用。DMSO 可以直接溶解,无需配制,使用方便,溶解速度快,但对人体毒性较大,且需去除原培养液,在去除培养液的过程中,可能会把结晶去掉,导致结果不稳定。4.实验步骤:4.1 细胞标准曲线制作4.1.1 0.5%的胰酶消化对数期细胞,待细胞即将脱离皿底时,加少量血清终止反应,1000

3、r/min,离心 5min,吸去上清,将细胞沉淀用培养基吹打混匀,制成细胞悬液,细胞计数后调整其浓度至 5-10104/ml。4.1.2 取 4 块 96 孔板,分别标记为 0h、24h、48h、72h,每组设置 3 个复孔,每孔加入 100 L 细胞悬液,每板分别铺 8 组细胞,分别为 3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000 个/孔,边缘孔用无菌 PBS 填充以消除边缘效应。4.1.3 5%CO2,37培养箱继续培养,每 24 h 取出一块 96 孔板检测:a)每孔加入 10 L MTT 溶液(5mg/ml),继续细胞培养箱培养 4-6h;b)小心吸

4、去孔内培养液;c)每孔加入 150L DMSO,使结晶物充分溶解;d)加 DMSO 后 10min 内,用酶标仪检测各孔波长 l570nm 的吸光值;4.1.4 标准曲线制作以时间为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制细胞增殖标准曲线。选择合适的细胞浓度进行实验。4.2 MTT 药物毒性实验步骤4.2.1 0.5%的胰酶消化对数期细胞,加少量血清终止反应,1000r/min,离心5min,吸去上清,将细胞沉淀用培养基吹打混匀,制成细胞悬液,细胞计数后调整其浓度至 5-10104/ml,药物毒性实验一般每孔细胞数量 500010000 个(具体数目根据预实验判断)。此外,还应根据细胞本身特性,如生长快慢

5、,来决定细胞数量。比如:生长较快的细胞密度可略小。4.2.2 将细胞悬液制备好后,轻轻混匀,每孔加入 90l 细胞悬液,这样待测细胞的密度为 500010000/孔(边缘孔用无菌 PBS 填充)。注意:因细胞在混匀后仍要继续沉降,因此接种的过程中要反复多次混匀,如每加 5 个孔就混匀一次,以确保接种的细胞密在各孔之间完全相同,这对于 MTT 的结果至关重要。4.2.3 5%CO2,37培养箱继续培养,待细胞单层铺满孔底(96 孔平底板),加入浓度梯度的药物。(原则上,细胞贴壁后即可加药,或两 h,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药。加药时按照所需的浓度在 EP 管中先稀释好,每

6、孔加入 10l 已经稀释好药物,使每孔最终体积为 100l,为了避免产生误差,稀释好的药物体积应略大于所需药物的体积。需要注意的是,以 DMSO 作为溶剂溶解的药物至少需要进行 100 倍以上稀释才能使用,因为作用于细胞 DMSO 的含量高于 1%时,DMSO 会杀死细胞从而影响判断。)4.2.4 按照药物作用时间点,每 24 h 取出一块 96 孔板检测:a)每孔加入 10 L MTT 溶液(5mg/ml),继续细胞培养箱培养 4-6h;b)小心吸去孔内培养液;c)每孔加入 150L DMSO,置摇床上低速振荡 10min,使结晶物充分溶解;d)加 DMSO 后 10min 内,用酶标仪检测

7、各孔波长 570nm 的吸光值;4.2.5 同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。4.2.6 MTT 结果分析IC50 值可以通过 Graphpad prism5 进行计算4.3 MTT 增殖实验4.3.1 分别收集各组对数期的细胞,调整细胞悬液浓度;4.3.2 取 4 块 96 孔板,每孔加入 100 L 细胞悬液,铺板使待测细胞为5103 cell/孔(边缘孔用无菌 PBS 填充以消除边缘效应),每组设置 3 个复孔;4.3.3 5%CO2,37培养箱继续培养,每 24 h 取出一块 96 孔板检测:a)每孔加入 20 L MTT 溶液(5mg/ml),继续细胞培养箱培养 4h;b)小心吸去孔内培养液;c)每孔加入 150L DMSO,使结晶物充分溶解;d)加 DMSO 后 10min 内,用酶标仪检测各孔波长 570nm 的吸光值。4.3.4 数据处理及 MTT 增殖曲线绘制。