实时定量学习.pptx

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1、Polymerase Chain Reaction（PCR）聚合酶链式反应伟大的天才发现！第1页/共60页Kary B.Mullis 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。第2页/共60页1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链PCR的基本原理第3页/共60页PCR的基本原理模板DNA94第4页/共60页50-65引物1引物2DNA引

2、物72第5页/共60页PCRPCR的基本原理的基本原理引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶第6页/共60页PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束94第2轮开始第7页/共60页PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50-65TaqTaqTaqTaq72第8页/共60页PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第2轮结束第9页/共60页PCR基本原理第10页/共60页MgMg2+2+模板模板引物引物dNTPdNTPDNADNA聚合酶聚合酶PCRPCR反应基本要素第11页/共60页 1、单、双链DN

3、A，cDNA均可 2、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂DNA结合蛋白类 3、一般100ng DNA模板/100 L,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加（1）模板 第12页/共60页 1、引物浓度一般为0.1-0.5 mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降 2、引物的设计 （2）引物第13页/共60页（3）Taq DNA聚合酶 1、酶的用量一般为0.5-2.5 U/50 l，2、酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。第14页/共60页（4）Mg2+1、Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，一般用量为0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。2、Mg2+浓度

4、过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。3、Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。第15页/共60页 1、dNTP浓度取决于扩增片段的长度 2、四种dNTP浓度应相等 3、浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 4、dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5）dNTP第16页/共60页(1)(1)变性变性 使双链使双链DNADNA解链为单链解链为单链,9494 3 30-0-4 40 0s s(2)(2)退火退火温度由温度由引物长度引物长度和和GCGC含量含

5、量决定。决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。降低温度可增加反应的灵敏性。第17页/共60页循环参数循环参数（3 3）延伸）延伸6868-7-75 5,一般为一般为7272延伸时间由扩增片段长度决定延伸时间由扩增片段长度决定（4 4）循环次数）循环次数主要取决于模板主要取决于模板DNADNA的浓度的浓度,一般为一般为25-3525-35次次次数过多次数过多,扩增效率降低扩增效率降低,错误掺入率增加错误掺入率增加第18页/共60页常用PCR反应体系(以HiFi Taq为例)模板 1.0 L上游引物 0.5 L下游引物 0.

6、5 L10X HiFi Buffer（+Mg2+）2.5 LdNTPs 2.0 LHiFi Taq酶 0.2-0.3 LddH2O 补足25 L共 25 L第19页/共60页常用PCR反应条件94 2-5min94 30-40sTm 30-45s72 1min/1kb72 10min12 +25-35个循环第20页/共60页几种常用PCR技术RT-PCR(Reverse Transcription PCR)反向PCR (Reverse PCR)RACE(Rapid-Amplification of cDNA Ends)qRT-PCR(Q uantitative Real Time PCR)第2

7、1页/共60页基因基因mRNAmRNA蛋白质多肽链蛋白质多肽链RT-PCR(反转录PCR)DNA水平RNA水平蛋白水平第22页/共60页RT-PCR基本原理mRNAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTReverse TranscriptionmRNAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTcDNA第23页/共60页RT-PCR一般步骤1、RNA提取RNA质量的检测一般RT-PCR要求提取的RNA要有较高的完整性和纯度完整性检测（1%琼脂糖胶电泳）纯度检测（OD260/280）OD260/280一般介于1.9-2.1之间，小于1.9时蛋白污染；大于2.1时RNA发生降解28S

8、18S5S第24页/共60页2、反转录RT-PCR一般步骤在冰盒上加入以下试剂：组成体积随机引物随机引物或或Oligo dT）1L1-5g Total RNAxLDEPC-Treated H2OyL 体系配制完成后瞬时离心，70反应5min,然后迅速转移至冰盒，冰浴2-5min,此步骤的作用是去除mRNA的二级结构。第25页/共60页RT-PCR一般步骤组成体积5X Buffer4LdNTPs1LRNAse inhibitor1LM-MLV1LDEPC-Treated H2OxL1、混匀，42，90min2、70，10min，终止反应3、A3检测在冰盒上加入以下试剂：第26页/共60页反向PC

9、R(reverse）PCR)已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列v反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。v可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。第27页/共60页已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶反向PCR原理第28页/共60页cDNA 末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)是一种基于PCR技术从低丰度的转录本中

10、快速扩增cDNA 的5和3末端的有效方法,以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。RACE(rapid-amplification of cDNA ends)第29页/共60页AAAAAAAAmRNA接头序列AAAAAAAAmRNAGeneRacer 3PrimerGSP2GeneRacer 3Nested PrimerNGSP2Reverse transcriptionGeneRacer Oligo dT PrimerTTTTTTTTTGTGACAGTACGGCAATGCATCGCATAGCAACTGTCGcDNATTTTTTTTTGTGACAGTACGGCAATGCATCGCATA

11、GCAACTGTCG已知片段RACE 3RACE原理第30页/共60页mRNAAAAAAAmRNANNNNNNNNNNNAAAAAAOligo dTReverse TranscriptionNGSP1GeneRacer 5Nested PrimerGSP1GeneRacer 5 PrimerGeneRacer RNA Oligo SequenceNNNNNNNNNNN接头序列TTTTTTNNNNNNNNNNNcDNAmRNAAAAAAANNNNNNNNNNN已知片段5RACE原理第31页/共60页qRT-PCR(Quantitative Real Time PCR)通过通过荧光染料荧光染料或荧

12、光标记的特异性或荧光标记的特异性探针探针,对对PCRPCR产物进行标记跟踪产物进行标记跟踪,实时在线监控反实时在线监控反应过程应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。计算待测样品的初始模板量。内掺式染料内掺式染料 SYBR GreenSYBR Green I 序列特异性探针序列特异性探针 TaqmanTaqman Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET)引物特异性探针引物特异性探针 Amplifluor(Intergen)Ampliflu

13、or(Intergen)第32页/共60页1、SYBR Green 法第33页/共60页SYBR Green 工作原理第34页/共60页SYBR Green法优缺点第35页/共60页融解曲线（dissociation curve）第36页/共60页正常有非特异性扩增第37页/共60页 2、TaqMan探针法第38页/共60页作用机理TaqMan第39页/共60页TaqMan法与SYBR Green I的比较第40页/共60页第41页/共60页几个重要概念第42页/共60页基线（Baseline）第43页/共60页荧光阈值（threshold）荧光阈值（threshold）是在荧光扩增曲线上人为

14、设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。荧光域值是PCR315个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在 PCR扩增的指数期。第44页/共60页Ct值（threshold value）每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 Ct 值。研究表明，各模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。反之亦然。第45页/共60页定量PCR的数学原理第46页/共60页第47页/共60页荧光定量PCR的解析方法第48页/共60页相对定量内参基因目的基因120.2第49页/

15、共60页内参基因内参基因：qRT-PCR时，每个标本都要做对应的内参，而且每次都是管家基因，一般用-actin，有时也用GAPDH。管家基因：又称持家基因(house-keeping genes)生物体各类细胞中都表达，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的蛋白质编码的基因。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。是为维持细胞基本生命活动所需而时刻都在表达的基因。第50页/共60页内参基因的选择理想的内参基因应该满足以下条件：1、不存在假基因，以避免基因 DNA的扩增2、高度或中度表达，排除低表达3、稳定表达于不同类型的细胞和组织（如正常细胞和癌细胞），而且其表达量是近似的，无显着性

16、差别4、表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关5、其稳定的表达水平与目标基因相似6、不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响 第51页/共60页常用内参基因第52页/共60页家蚕常用内参基因Actin3GAPDH sw22934第53页/共60页数据处理（Ct法）第54页/共60页qRT-P C R的优点及限制因素qRT-PCR不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有操作简便、快速高效、敏感性高、特异性强、有效解决了PCR污染的问题、自动化程度高等特点第55页/共60页qRT-PCR限制因数实验费用昂贵，需要设置多组重复和对照怎样避免扩增基因组DN

17、A、如何消除和评定由于样品处理、仪器的差异和个人操作而带来的误差以及如何更准确定量基因？值得指出的是，qRT-PCR只能定量mRNA水平，但mRNA水平可能不能反映细胞中蛋白水平，因为在转录后还有诸多调节因素。要准确而全面的了解机体的表达水平，除了分析mRNA水平外，还需要免疫组织化学和生物化学实验的数据。第56页/共60页更多关于qRT-PCR的信息，请参照：第57页/共60页引物设计引物设计常用引物设计软件：primer Premier，Oligo序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列引物长度：17-25bp碱基尽可能随机分布,GC%：40%-60%尽量避免错配（False Priming)、引物二聚体(Dimer)和发夹结构（Hairpin）第58页/共60页引物设计引物长度：17-25bpGC%:40-60%Tm:60（Primer Premier 5.0）产物长度：80-300bp,100-200bp最佳第59页/共60页感谢您的观看。第60页/共60页