实时荧光定量PCR介绍教案.pptx

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1、会计学1实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍主主 要要 内内 容容Real Time PCRReal Time PCR基础知识基础知识12Real Time PCRReal Time PCR实验方法实验方法3Real Time PCRReal Time PCR解析方法解析方法4Real Time PCRReal Time PCR应用实例应用实例第1页/共51页Real Time PCRReal Time PCR基础知识基础知识1.Real Time PCR的用途及原理2.Real Time PCR的检测方法Real Time PCRReal Time PCR基础知识基础知识1第2页/共51页

2、Real Time PCR的用途的用途Real Time PCRReal Time PCRReal Time PCRReal Time PCR用途用途用途用途定性分析定性分析定性分析定性分析定量分析定量分析定量分析定量分析病毒及病原菌定量分析病毒及病原菌定量分析导入基因拷贝数解析导入基因拷贝数解析GMO定量检测定量检测差异显示结果验证差异显示结果验证基因芯片结果验证基因芯片结果验证siRNA效果确认效果确认mRNA表达量分析表达量分析病毒及病原菌检测病毒及病原菌检测物种鉴定物种鉴定基因分型基因分型绝对定量绝对定量绝对定量绝对定量相对定量相对定量相对定量相对定量第3页/共51页Real Time

3、 PCRReal Time PCR的原理的原理 激激发光光发射光射光使用使用Real Time PCRReal Time PCR扩增装置实时监测扩增装置实时监测PCRPCR扩增产物并进行分析的方法。扩增产物并进行分析的方法。Real Time PCRReal Time PCRCt值第4页/共51页Real Time PCRReal Time PCR基础知识基础知识1.Real Time PCR的用途及原理2.Real Time PCR的检测方法Real Time PCRReal Time PCR基础知识基础知识1第5页/共51页TaqManProbeTaqManProbeCyclingCycl

4、ingProbeProbeMolecularMolecularBeaconBeaconetc.SYBR SYBR SYBR SYBR Green IGreen IGreen IGreen I荧光染料嵌合法荧光染料嵌合法荧光探针法荧光探针法Real Time PCRReal Time PCR的检测方法的检测方法第6页/共51页荧光染料嵌合法（荧光染料嵌合法（SYBR Green ISYBR Green I）SYBR Green ISYBR Green I：是一种能结合于所有：是一种能结合于所有dsDNAdsDNA双螺旋小沟区域的双螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。具有绿色激发波长的染料。S

5、YBR Green ISYBR Green ISYBR Green ISYBR Green I第7页/共51页Primer退退 火火 FFFFSYBR Green I 法法作用机理示意图作用机理示意图Pol.FPrimerPol.延延 伸伸 FFFFFFPrimer热变热变性性 FFFF第8页/共51页TaqManTaqMan法作用机理法作用机理TaqManTaqMan探针为一寡核苷酸，探针为一寡核苷酸，5 5 端标记一个报告基团（端标记一个报告基团（ReporterReporter），），3 3 端标记一个淬灭基团（端标记一个淬灭基团（QuencherQuencher）。）。RQ第9页/共5

6、1页RQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.热变热变性性 退退 火火 延延 伸伸 TaqMan ProbeTaqMan Probe法原理示意图法原理示意图 第10页/共51页 One-Step RT-PCR特异性高特异性高多重多重PCRPCR检出检出ProbeProbe设计要求高设计要求高 ProbeProbe法法 ProbeProbe合成费用高合成费用高SYBR Green I SYBR Green I 法与法与ProbeProbe法比较法比较常用于常用于mRNAmRNA表达量分析等表达量分析等SYBR Green I SYBR Green I 法法 简便易行简便易行

7、价格便宜价格便宜要求反应的特异性要求反应的特异性不能进行多重不能进行多重PCRPCR常用于常用于SNPSNP解析，病毒、病源菌检测解析，病毒、病源菌检测第11页/共51页主主 要要 内内 容容2Real Time PCR实验方法反转录反应反转录反应反转录反应反转录反应Real Time PCRReal Time PCRReal Time PCRReal Time PCR反应反应反应反应第12页/共51页RTRT PrimerPrimer的选择的选择 Random PrimerRandom Primer Oligo dT PrimerOligo dT Primer Gene Specific P

8、rimer Gene Specific PrimerRandom 6mer PrimerRandom 6mer PrimerGene Specific PrimerGene Specific PrimerOligo dT PrimerOligo dT PrimerPCR R-PrimerPCR R-PrimerPCR F-PrimerPCR F-Primer第13页/共51页目的片段在距目的片段在距Poly(A)Tail Poly(A)Tail 1.5 kbp 1.5 kbp 以内适用，以内适用，RTRT效率效率较高。较高。One Step RT-PCR One Step RT-PCR 只能使

9、只能使用用Gene Specific PrimerGene Specific Primer，但不适用于复数基因的检但不适用于复数基因的检出。出。5 53 3Gene Specific PrimerGene Specific Primer目的片段目的片段R RF FAAAAAA5 53 3目的片段目的片段R RF F1,500 base1,500 baseOligo dT PrimerOligo dT PrimerRandomRandom目的片段目的片段5 53 3R RF F目的片段在目的片段在mRNAmRNA任何位任何位置都能使用。通常置都能使用。通常mRNAmRNA表达量分析最适。表达量分

10、析最适。Oligo dT PrimerOligo dT Primer5 53 3R RF FAAAAAA目的片段目的片段RandomRandom适用于适用于mRNAmRNA表达量分析，表达量分析，提升反应检测的灵敏度。提升反应检测的灵敏度。RTRT PrimerPrimer的选择的选择第14页/共51页Real Time PCRReal Time PCR引物设计引物设计目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。体要求不严格。目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严

11、格。性反应和引物二聚体要求严格。Real Time PCRReal Time PCR用引物与普通用引物与普通PCRPCR引物设计要求不同引物设计要求不同=对引物设计要求严格对引物设计要求严格普通普通PCRPCR引物引物Real Time PCRReal Time PCR引物引物第15页/共51页两条引物的两条引物的TmTm值尽量接近，应用专用软件计算值尽量接近，应用专用软件计算TmTm值值 TmTm值值40-60%(40-60%(最好最好45-55%)45-55%)GCGC含量含量PrimerPrimer长度长度80-150 bp(80-150 bp(尽量限制在尽量限制在300 bp300 b

12、p以内以内)扩增片段大扩增片段大小小17-25 base17-25 base使用使用BLASTBLAST检索，确认引物特异性检索，确认引物特异性 特异性特异性 引物内部或两条引物之间避免引物内部或两条引物之间避免3 base3 base以上的互补序列以上的互补序列 引物引物3 3 末端避免末端避免2 base2 base以上的互补序列以上的互补序列 互补性互补性3 3 末端序列末端序列 整体上碱基不能过偏整体上碱基不能过偏 个别部分避免个别部分避免GC richGC rich或或AT rich(AT rich(特别是特别是3 3 端端)避免避免T/CT/C连续，连续，A/GA/G连续连续序列序

13、列 3 3 末端避免末端避免GC richGC rich或或AT richAT rich 3 3 末端碱基最好为末端碱基最好为G G 或或C C 3 3 末端碱基尽量避免为末端碱基尽量避免为T T尽量在尽量在Exon junctionExon junction上设计引物，限制基因组上设计引物，限制基因组DNADNA扩增扩增 RT-PCRRT-PCR用引物用引物Real Time PCRReal Time PCR引物设计原则引物设计原则第16页/共51页探针的探针的TmTm比引物高比引物高8-108-10 TmTm值值20-24 bp20-24 bp ProbeProbe长度长度探针探针5 5

14、末端的第一个碱基不能是末端的第一个碱基不能是G G5 5 末端序列末端序列 目的序列目的序列GCGC含量相对较高的区域设计含量相对较高的区域设计 整体上碱基不能过偏整体上碱基不能过偏 个别部分避免个别部分避免GC richGC rich或或AT rich(AT rich(特别是特别是3 3 端端)；避免；避免T/C T/C 连续，连续，A/CA/C连续连续序列序列ProbeProbe内部或内部或ProbeProbe与两条引物之间避免与两条引物之间避免3 base3 base以上的互补序列以上的互补序列 互补性互补性BLASTBLAST检索确认检索确认ProbeProbe特异性特异性 特异性特异

15、性Real Time PCRReal Time PCR用用TaqManTaqMan探针设计原则探针设计原则Real Time PCRReal Time PCR探针设计原则探针设计原则第17页/共51页线性关系、扩增效率确认线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认检测灵敏度确认PCRPCR扩增效率（扩增效率（E E）：）：0.8-1.20.8-1.235Cycles35Cycles内可得到好的定量结果。内可得到好的定量结果。如果采用如果采用SYBRSYBR检测方法，检测方法，30Cycles30Cycles内无非特异性产物扩增。内无非特异性产物扩增。No No T Template emplate

16、C Controlontrol确认确认30Cycles30Cycles内无引物二聚体产生。内无引物二聚体产生。相关系数（相关系数（r r2 2）：大于）：大于0.980.98反应性能确认反应性能确认第18页/共51页主主 要要 内内 容容3Real Time PCR解析方法1.标准曲线分析2.融解曲线分析3.绝对定量和相对定量解析方法第19页/共51页标准曲线制作标准曲线制作扩增曲线扩增曲线标准曲线标准曲线标准品梯度的选择：标准品梯度的选择：5 56 6个梯度个梯度标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为标准品稀释倍数通常为101010105 5 10104 4 101

17、03 3 10102 2 10101 1 10100 0 10105 5 10104 4 10 103 3 10 102 2 10 101 1 10 100 0第20页/共51页标准品的种类标准品的种类 基因组基因组DNADNA 质粒质粒 Total RNA&Total RNA&cDNAcDNA 体外转录体外转录RNARNADNADNA样品定量标准样品定量标准品品 RNARNA样品定量标准品样品定量标准品第21页/共51页质粒标准品构建流质粒标准品构建流程程基因组基因组DNADNAPCRPCR目的基因克隆目的基因克隆目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因质粒质粒质粒提取，质粒提取，O

18、DOD值定量。将质粒梯度稀释至值定量。将质粒梯度稀释至10105 5-10-101 1 copies/ulcopies/ul，作为标准品。，作为标准品。第22页/共51页体外转录体外转录RNARNA标准品构建流程标准品构建流程RNARNA纯化后，测纯化后，测ODOD定量。将定量。将RNARNA梯度稀释至梯度稀释至10105 5-10-101 1 copies/ulcopies/ul，作为标准品。，作为标准品。T7 RNA polymeraseT7 RNA polymerase体外转录体外转录RNARNATotal Total RNARNAPCRPCRcDNAcDNARTRTT7 Promote

19、rT7 PromoterTTTTTTTTTTPCRPCR产物产物目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因AAAAAAAAAAAAAAAAAAA A第23页/共51页理想的标准品扩增曲线理想的标准品扩增曲线基线平整基线平整Negative ControlNegative Control为水平线为水平线指数区较明显，陡度大指数区较明显，陡度大平台区汇于一起平台区汇于一起线性范围宽线性范围宽第24页/共51页理想的标准曲线理想的标准曲线 相关系数（相关系数（r r2 2）：大于）：大于0.980.98，越接近，越接近1 1，结果可信度越高。，结果可信度越高。扩增效率（扩增效率（E E）：）：

20、0.8-1.20.8-1.2，越接近，越接近1 1，越理想。，越理想。扩增效率扩增效率 相关系数相关系数 扩增效率（扩增效率（E E）计算方法）计算方法 标准曲线标准曲线X X轴表示起始模板浓度（轴表示起始模板浓度（loglog1010)，Y Y轴表示轴表示CtCt值时值时 E=10E=10-1/a-1/a-1-1 标准曲线标准曲线X X轴表示轴表示CtCt值，值，Y Y轴表示起始模板浓度（轴表示起始模板浓度（loglog1010)E=10 E=10-a-a-1 -1 第25页/共51页Real Time PCRReal Time PCR解析方法解析方法3Real Time PCR解析方法1.

21、1.标准曲线分析标准曲线分析2.2.融解曲线分析融解曲线分析3.3.绝对定量和相对定量解析方法绝对定量和相对定量解析方法第26页/共51页融解曲线分融解曲线分析析 Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度。SYBR Green I SYBR Green I 法进行检出时，法进行检出时，要根据融解曲线确认要根据融解曲线确认PCRPCR产物的特异性。产物的特异性。第27页/共51页特异性产物特异性产物非特异产物非特异产物引物二聚体引物二聚体对对PCRPCR产物特异性进行分析产物特异性进行分析融解曲线分融解曲线分析析第28页/共51页3Real Time PCR解析方法1.标准曲线分析2.融解曲线分

22、析3.绝对定量和相对定量解析方法Real Time PCR解析方解析方法法第29页/共51页绝对定量解析方法绝对定量解析方法提取样品提取样品引物设计引物设计标准品制备标准品制备Real Time PCRReal Time PCR反应反应数据分析数据分析流流程程第30页/共51页绝对定量解析方法绝对定量解析方法通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。10105 510104 410103 310101 1扩

23、增曲线图扩增曲线图标准曲线图标准曲线图 检测样检测样品品检测样检测样品品10102 2第31页/共51页相对定量解析方相对定量解析方法法以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正，以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正，进行相对表达量分析。进行相对表达量分析。Sample BSample A目的基因扩增效率相同RNA提取效率相同细胞起始数相同进行相对表达量分析必要性实际上目的基因表达量分析实际上目的基因表达量分析第32页/共51页相对定量解析方法相对定量解析方法管家基因管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如如：GA

24、PDHGAPDH、-actin-actin等。等。筛选方法筛选方法 根据文献提供根据文献提供 通过具体实验筛选通过具体实验筛选第33页/共51页主主 要要 内内 容容Real Time PCR基础知识12Real Time PCR实验方法3Real Time PCR解析方法4Real Time PCR应用实例 对对SARSSARS病毒基因进行定量分析病毒基因进行定量分析绝对定量绝对定量绝对定量绝对定量相对定量相对定量 分析小鼠分析小鼠PAH基因在不同组织中的表达量变化基因在不同组织中的表达量变化第34页/共51页绝对定量应用例绝对定量应用例 对对SARSSARS样品样品中所含中所含SARSSA

25、RS病毒病毒RNARNA进行定量进行定量 检测方法检测方法 TaqManTaqMan probe probe 法法 检测样品检测样品 3 3个从个从SARSSARS样品中提取的样品中提取的Total RNATotal RNA 目的基因目的基因 SARSSARS病毒病毒RNARNA 内内 参参 SARS Internal ControlSARS Internal Control RNARNA 标标 准准 品品 SARS Control RNASARS Control RNA 试试 剂剂 One Step PrimeScriptOne Step PrimeScript RT-PCR Kit RT-

26、PCR Kit （Perfect Real TimePerfect Real Time）（）（DRR064DRR064）仪仪 器器 Smart Cycler Smart Cycler 第35页/共51页 SYN247 F02SYN247 F02SYN247R03SYN247R03SYN247 F01SYN247 F01SYN247R02SYN247R02SYN247R01SYN247R01SYN247 F01SYN247 F01BamBamH H HinHind d pBluescript II SK(+pBluescript II SK(+)Vector)VectorT7 PromoterT

27、7 PromoterBamBamH H HinHind d Sac Sac site site SARS Control RNASARS Control RNA构建构建绝对定量应用例绝对定量应用例 对对SARSSARS培养液中所含培养液中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA进行定量进行定量第36页/共51页 纯化的纯化的SARS Control RNA ODSARS Control RNA OD值测定结果值测定结果 体外转录的体外转录的SARS Control RNA SARS Control RNA 电泳照片电泳照片M1 M2M1 M2M1:M1:-HinHind digest d di

28、gest M2:DL2,000 MarkerM2:DL2,000 MarkerDNase IDNase I处理前处理前DNase IDNase I处理后处理后绝对定量应用例绝对定量应用例 对对SARSSARS样品样品中所含中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA进行定量进行定量第37页/共51页 DNDNA A BNITMSARAs2 Adaptor R BNITMSARAs2 Adaptor R SacSacsite site Bam Bam Hsite Hsite BNITMSARS1 Adaptor F BNITMSARS1 Adaptor F T7 PromoterT7 Promot

29、erSARS Internal Control RNASARS Internal Control RNA的构建的构建A AA ApBluescriptII pBluescriptII SK(+SK(+)Vector)Vector 绝对定量应用例绝对定量应用例 对对SARSSARS样品样品中所含中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA进行定量进行定量第38页/共51页探针的选择探针的选择 TemplateTemplatePrimerPrimerTaqManTaqMan Probe Probe5 5 端报告基团端报告基团3 3 端淬灭基团端淬灭基团SARS Control RNASARS Con

30、trol RNAor SARS Genomic RNAor SARS Genomic RNA共用共用FAMFAM标记标记EclipseEclipse标记标记SARS Internal Control RNASARS Internal Control RNA共用共用ROXROX标记标记EclipseEclipse标记标记绝对定量应用例绝对定量应用例 对对SARSSARS样品样品中所含中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA进行定量进行定量第39页/共51页SARS Control RNA 10SARS Control RNA 105 5-10-101 1扩增曲扩增曲线线 SARS Genomi

31、c RNA Sample 1SARS Genomic RNA Sample 1、扩增曲、扩增曲线线 SARS Internal Control RNASARS Internal Control RNA扩增曲线扩增曲线 标准曲线标准曲线 绝对定量应用例绝对定量应用例 对对SARSSARS样品样品中所含中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA进行定量进行定量第40页/共51页定量结果定量结果对三个样品所含对三个样品所含SARSSARS病毒病毒RNARNA进行了准确定量。进行了准确定量。绝对定量应用例绝对定量应用例 对对SARSSARS样品样品中所含中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA进行定

32、量进行定量第41页/共51页相对定量应用例相对定量应用例 分析小鼠不同组织中分析小鼠不同组织中PAHPAH基因表达量的变化情况基因表达量的变化情况检测方法检测方法 SYBR Green I SYBR Green I 荧光嵌合法荧光嵌合法管家基因管家基因 GAPDHGAPDH基因基因目的基因目的基因 PAHPAH基因基因标标 准准 品品 cDNAcDNA试试 剂剂 PrimeScript RT PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser reagent Kit with gDNA Eraser （DRR047DRR047）SYBR SYBR Premi

33、x Ex TaqPremix Ex TaqTMTM II(Tli RNase H Plus)II(Tli RNase H Plus)（DRR820DRR820）仪仪 器器 Thermal Cycler DiceThermal Cycler Dice Real Time System Real Time System（TP800TP800）第42页/共51页Total RNATotal RNA提取提取Total RNATotal RNA基因组基因组DNADNA去除去除标准品标准品RNARNA制备制备标准曲线制作及预实验标准曲线制作及预实验详细的实验资料获详细的实验资料获取取实验设计及引物实验设计

34、及引物 设计、合成设计、合成样品样品Real Time PCRReal Time PCR反应反应相对定量计算及相对定量计算及数据分析数据分析数据整理及论文撰写数据整理及论文撰写相对定量应用例相对定量应用例 分析小鼠不同组织中分析小鼠不同组织中PAHPAH基因表达量的变化情况基因表达量的变化情况第43页/共51页提取提取Total RNATotal RNA后电泳照片后电泳照片提取试剂：提取试剂：TaKaRa RNAiso PlusTaKaRa RNAiso Plus （D9108 D9108）相对定量应用例相对定量应用例 分析小鼠不同组织中分析小鼠不同组织中PAHPAH基因表达量的变化情况基因表

35、达量的变化情况M C L B M MM：DL2,000 DNA MarkerDL2,000 DNA MarkerC C：Control RNAControl RNAL L：Liver RNALiver RNAB B：Brain RNABrain RNA第44页/共51页目目的的基基因因标标准准曲曲线线制制作作结结果果扩增曲线图扩增曲线图融解曲线图融解曲线图标准曲线图标准曲线图管管家家基基因因标标准准曲曲线线制制作作结结果果相对定量应用例相对定量应用例 分析小鼠不同组织中分析小鼠不同组织中PAHPAH基因表达量的变化情况基因表达量的变化情况第45页/共51页扩增曲线图扩增曲线图样品目的基因定量结

36、果样品目的基因定量结果样品管家基因定量结果样品管家基因定量结果管家基因管家基因 GAPDHGAPDH目的基因目的基因 PAHPAH定量结果定量结果平均值平均值定量结果定量结果平均值平均值通过通过GAPDHGAPDH校校正的正的PAHPAH校正值校正值小鼠肝脏和脑中小鼠肝脏和脑中PAHPAH的相对表达量的相对表达量样品样品a1a12288002288002221752221751966001966002011752011750.905 0.905 3757 3757 212700212700204400204400样品样品a2a2227300227300207100207100219900219

37、900196600196600样品样品 b1b133360033360034097534097576.80 76.80 82.1882.182.41102.4110-4-41 134030034030092.65 92.65 样品样品 b2b235410035410082.46 82.46 33590033590076.80 76.80 相对定量应用例相对定量应用例 分析小鼠不同组织中分析小鼠不同组织中PAHPAH基因表达量的变化情况基因表达量的变化情况第46页/共51页 通过双标准曲线方法计算得出，苯丙氨酸羟化酶（通过双标准曲线方法计算得出，苯丙氨酸羟化酶（PAHPAH）基因在小）基因在小鼠

38、肝脏中的表达量明显高于其在脑组织中的表达水平，二者的表达量比鼠肝脏中的表达量明显高于其在脑组织中的表达水平，二者的表达量比例约为例约为37573757：1 1。相对定量应用例相对定量应用例 分析小鼠不同组织中分析小鼠不同组织中PAHPAH基因表达量的变化情况基因表达量的变化情况第47页/共51页Real Time PCR Real Time PCR 试剂试剂 使用使用SYBRSYBR Green I Green I法检法检测测使用探针法检测使用探针法检测使用荧光探针检测使用荧光探针检测使用使用CyclingCycling探针检探针检测测扩增的模板扩增的模板GCGC含量含量高高或含有重复序列或含有重复序列第48页/共51页Real Time RT-PCR Real Time RT-PCR 试剂试剂 使用使用SYBRSYBR Green I Green I法检法检测测使用探针法检测使用探针法检测使用荧光探针检测使用荧光探针检测使用使用CyclingCycling探针检测探针检测第49页/共51页