《液相色谱基础》PPT课件.ppt

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1、液相色谱基础知识第一节第一节 色谱法概述色谱法概述第二节第二节 液相色谱法液相色谱法第三节第三节 液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语第四节第四节 HPLC的主要类型及原理的主要类型及原理第一节第一节 色谱法概述色谱法概述一、色谱法简介一、色谱法简介二、色谱法的定义和分类二、色谱法的定义和分类三、气相色谱和液相色谱的区别三、气相色谱和液相色谱的区别四、色谱法的分离原理四、色谱法的分离原理关于色谱关于色谱色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析仪器仪器常见的分离方式：常见的分离方式：蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤蒸馏、离心、电

2、泳、过滤、超滤蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤等等等等等等等等色谱是其中一种分离工具是其中一种分离工具一、色谱法简介一、色谱法简介色谱法（色谱法（色谱法（色谱法（ChromatographyChromatography）溯源溯源溯源溯源俄国科学家俄国科学家Tswett 1903Tswett 1903年发现色谱的吸附原理，年发现色谱的吸附原理，开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法并开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸于俄文的文献见诸于俄文的文献19061906年正式命名（见诸文献）年正式命名（见诸文献）年正式命名（见诸文献）年正式命名（见诸文献）色谱法；色谱法；Chromatography

3、Chromatography5050年代开始广泛研究和应用年代开始广泛研究和应用年代开始广泛研究和应用年代开始广泛研究和应用主要是气相色谱及薄层色谱主要是气相色谱及薄层色谱高效液相色谱法的广泛应用始于高效液相色谱法的广泛应用始于高效液相色谱法的广泛应用始于高效液相色谱法的广泛应用始于7070年代年代年代年代色谱的发明人色谱的发明人t t俄国科学家：俄国科学家：M.S.TswettM.S.Tswettt t正式命名正式命名“色谱色谱”的文献的文献色谱起源色谱起源石油醚碳酸钙颗粒色素玻璃柱经典液相色谱经典液相色谱二、色谱法的定义和分类二、色谱法的定义和分类 色谱法的定义：色谱法又称色层法或层析法，

4、是一种利用不色谱法又称色层法或层析法，是一种利用不色谱法又称色层法或层析法，是一种利用不色谱法又称色层法或层析法，是一种利用不同溶质同溶质同溶质同溶质(样品样品样品样品)与固定相和流动相之间的作用力与固定相和流动相之间的作用力与固定相和流动相之间的作用力与固定相和流动相之间的作用力(分分分分配、吸附、离子交换等配、吸附、离子交换等配、吸附、离子交换等配、吸附、离子交换等)的差别，当两相做相对移的差别，当两相做相对移的差别，当两相做相对移的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次动时，各溶质在两相间进行多次动时，各溶质在两相间进行多次动时，各溶质在两相间进行多次“平衡平衡平衡平衡”，使各

5、，使各，使各，使各溶质达到相互分离的方法。溶质达到相互分离的方法。溶质达到相互分离的方法。溶质达到相互分离的方法。固定相：在色谱分离中固定不动、对样品产生保固定相：在色谱分离中固定不动、对样品产生保固定相：在色谱分离中固定不动、对样品产生保固定相：在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。留的一相。留的一相。留的一相。流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向一流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向一流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向一流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体。定方向移动的液体或气体。定方向移动的液体或气体。定方向移动的液体或气体。色谱法的分类

6、根据流动相的状态将色谱法分成四大类。表表表表1 1 色谱法以流动相种类的分类色谱法以流动相种类的分类色谱法以流动相种类的分类色谱法以流动相种类的分类色谱类型色谱类型色谱类型色谱类型流动相流动相流动相流动相主要分析对象主要分析对象主要分析对象主要分析对象气相色谱法气相色谱法气相色谱法气相色谱法气体气体气体气体挥发性有机化合物挥发性有机化合物挥发性有机化合物挥发性有机化合物液相色谱法液相色谱法液相色谱法液相色谱法液体液体液体液体溶于水或有机溶剂的各溶于水或有机溶剂的各溶于水或有机溶剂的各溶于水或有机溶剂的各种物质种物质种物质种物质超临界色谱超临界色谱超临界色谱超临界色谱法法法法超临界流体超临界流体

7、超临界流体超临界流体各种有机化合物各种有机化合物各种有机化合物各种有机化合物电色谱法电色谱法电色谱法电色谱法缓冲溶液、电场缓冲溶液、电场缓冲溶液、电场缓冲溶液、电场离子和各种有机化合物离子和各种有机化合物离子和各种有机化合物离子和各种有机化合物1 1.按两相分子的聚集按两相分子的聚集按两相分子的聚集按两相分子的聚集状态分类状态分类状态分类状态分类2.2.按固定相的固定按固定相的固定按固定相的固定按固定相的固定方式分类方式分类方式分类方式分类平面色谱 纸色谱薄层色谱高分子薄膜色谱柱 色 谱 填充柱色谱 毛细管柱色谱 分配色谱：利用分配系数的不同吸附色谱：利用物理吸附性能的差异离子交换色谱：利用离

8、子交换原理空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同3.3.按分离机制分类按分离机制分类按分离机制分类按分离机制分类流动相 固定相 类型液体 固体 液-固色谱液体 液体 液-液色谱气体 固体 气-固色谱气体 液体 气-液色谱液相色谱 气相色谱 三、液相色谱与气相色谱的比较三、液相色谱与气相色谱的比较 液相色谱所用基本概念与所用基本理论均液相色谱所用基本概念与所用基本理论均与气相色谱一致。但由于在液相色谱中以液体与气相色谱一致。但由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的仪气体的性质不相同；此外，液相色谱所

9、用的仪器设备和操作条件也与气相色谱不同，所以，器设备和操作条件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别。液相色谱与气相色谱有一定差别。（1 1 1 1）应用范围不同）应用范围不同）应用范围不同）应用范围不同 气相色谱仅能分析在操作温度下气相色谱仅能分析在操作温度下气相色谱仅能分析在操作温度下气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不能气化而不能气化而不能气化而不分解分解分解分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、热不稳定化合物、

10、离子型化合物及高聚物的分离、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难；而液相色谱则不受样品挥发度和分析较为困难；而液相色谱则不受样品挥发度和分析较为困难；而液相色谱则不受样品挥发度和分析较为困难；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物化、不易挥发或对热敏感

11、的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析。及高聚物的分离分析。及高聚物的分离分析。及高聚物的分离分析。（2 2 2 2）液相色谱能完成难度较高的分离工作）液相色谱能完成难度较高的分离工作）液相色谱能完成难度较高的分离工作）液相色谱能完成难度较高的分离工作 气相色谱的流动相载气是惰性的，不参与分配气相色谱的流动相载气是惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。与固定相相互作用。而在液相色谱中流动相液体而在液相色谱中流动相液体而在液相色谱中流动相液体而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了也与固定

12、相争夺样品分子，为提高选择性增加了也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素一个因素一个因素一个因素。液相色谱固定相类型多，如离子交换色液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，作为分析时选择余地大；谱和排阻色谱等，作为分析时选择余地大；而气相色谱是不可能的。而气相色谱是不可能的。液相色谱通常在室温下操作，较低的温液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。度，一般有利于色谱分离条件的选择。四、色谱法的分离原理四、色谱法的分离原理1 1液固色谱法液固色谱法液固色谱法液固色谱法分离原理分离原理：使用固体吸附剂，根据

13、固定相对样品组分：使用固体吸附剂，根据固定相对样品组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附解吸吸附解吸吸附解吸吸附解吸附附附附的平衡过程。的平衡过程。吸附剂吸附剂：为硅胶或氧化铝，粒度：为硅胶或氧化铝，粒度5-10m5-10m。适用对象适用对象：适用于分离分子量：适用于分离分子量200-1000200-1000的组分，大多的组分，大多数用于非离子型化合物，常用于分离同分异构体。数用于非离子型化合物，常用于分离同分异构体。2 2液液色谱法液液色谱法液液色谱法液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于基质表面，或化学使用将特定的液态物质涂于基质表面，或化学键合于基

14、质表面而形成的固定相，分离原理是根据键合于基质表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个离。分离过程是一个分配平衡分配平衡分配平衡分配平衡过程过程。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法正相色谱法(NPC)(NPC)和反相色谱法和反相色谱法(RPC)(RPC)。正相色谱法正相色谱法正相色谱法正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水

15、性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物。化合物。反相色谱法反相色谱法反相色谱法反相色谱法一般用非极性固定相（如一般用非极性固定相（如C18C18、C8C8）；）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化节保留时

16、间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。合物。正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法与反相色谱法比较表 正相色谱法正相色谱法正相色谱法正相色谱法反相色谱法反相色谱法反相色谱法反相色谱法固定相极性固定相极性固定相极性固定相极性高高高高-中中中中中中中中-低低低低流动相极性流动相极性流动相极性流动相极性低低低低-中中中中中中中中-高高高高组分洗脱次序组分洗脱次序组分洗脱次序组分洗脱次序极性小先洗出极性小先洗出极性小先洗出极性小先洗出极性大先洗出极性大先洗出极性大先洗出极性大先洗出第二节第二节 液相色谱法液相色谱法一、液相色谱的分类一、液相色谱的分类二、高效二、高效液相液相色谱的特点色谱的特点三、高

17、效液相色谱法的仪器配置三、高效液相色谱法的仪器配置四、四、高效高效液相液相色谱的基本流程色谱的基本流程五、高效五、高效液相液相色谱的应用色谱的应用液相色谱的分类液相色谱的分类根据固定相的使用形式将液相色谱分成以下几类：根据固定相的使用形式将液相色谱分成以下几类：根据固定相的使用形式将液相色谱分成以下几类：根据固定相的使用形式将液相色谱分成以下几类：1.1.柱色谱：固定相装在玻璃管或金属管内，或涂在柱柱色谱：固定相装在玻璃管或金属管内，或涂在柱柱色谱：固定相装在玻璃管或金属管内，或涂在柱柱色谱：固定相装在玻璃管或金属管内，或涂在柱内壁上。又分为填充柱色谱和空心毛细管色谱两种内壁上。又分为填充柱色

18、谱和空心毛细管色谱两种内壁上。又分为填充柱色谱和空心毛细管色谱两种内壁上。又分为填充柱色谱和空心毛细管色谱两种类型。类型。类型。类型。2.2.纸色谱：用滤纸做载体，吸附在滤纸上的水为固定纸色谱：用滤纸做载体，吸附在滤纸上的水为固定纸色谱：用滤纸做载体，吸附在滤纸上的水为固定纸色谱：用滤纸做载体，吸附在滤纸上的水为固定相，试样溶液在纸上进行展开、分离。相，试样溶液在纸上进行展开、分离。相，试样溶液在纸上进行展开、分离。相，试样溶液在纸上进行展开、分离。3.3.薄层色谱：将固定相均匀地涂铺在玻璃板或塑料板薄层色谱：将固定相均匀地涂铺在玻璃板或塑料板薄层色谱：将固定相均匀地涂铺在玻璃板或塑料板薄层色

19、谱：将固定相均匀地涂铺在玻璃板或塑料板上，样品的展开、分离在玻璃板或塑料板上进行。上，样品的展开、分离在玻璃板或塑料板上进行。上，样品的展开、分离在玻璃板或塑料板上进行。上，样品的展开、分离在玻璃板或塑料板上进行。4.高效液相色谱高效液相色谱High Performance Liquid ChromatographyHigh Performance Liquid Chromatography高效液相色谱法，简称：高效液相色谱法，简称：HPLCHPLC是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段。效能分离手段。广泛应用于各个领域：广泛应用于各个

20、领域：医药医药/环保环保/石化石化/生命科学生命科学/食品及农食品及农业业在技术，理论及应用上仍处于发展阶段在技术，理论及应用上仍处于发展阶段HPLC的特点的特点高压高压高压高压压力可达压力可达压力可达压力可达150-300 Kg/cm150-300 Kg/cm150-300 Kg/cm150-300 Kg/cm2 2 2 2。色谱柱每米降。色谱柱每米降。色谱柱每米降。色谱柱每米降压为压为压为压为75 Kg/cm75 Kg/cm75 Kg/cm75 Kg/cm2 2 2 2以上。以上。以上。以上。高速高速高速高速流速为流速为流速为流速为0.1-10.0 ml/min0.1-10.0 ml/mi

21、n0.1-10.0 ml/min0.1-10.0 ml/min。高效高效高效高效可达可达可达可达5000500050005000塔板每米。在一根柱中同时分离塔板每米。在一根柱中同时分离塔板每米。在一根柱中同时分离塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达成份可达成份可达成份可达100100100100种。种。种。种。高灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度紫外检测器灵敏度可达紫外检测器灵敏度可达紫外检测器灵敏度可达紫外检测器灵敏度可达0.01ng0.01ng0.01ng0.01ng，同时，同时，同时，同时消耗样品少。消耗样品少。消耗样品少。消耗样品少。HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：与经典液相色谱相比

22、有以下优点：速度快速度快速度快速度快通常分析一个样品在通常分析一个样品在通常分析一个样品在通常分析一个样品在15-30 min15-30 min15-30 min15-30 min。分辨率高分辨率高分辨率高分辨率高可选择固定相和流动相以达到最佳可选择固定相和流动相以达到最佳可选择固定相和流动相以达到最佳可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。分离效果。分离效果。分离效果。柱子可反复使用柱子可反复使用柱子可反复使用柱子可反复使用用一根色谱柱可分离不同的用一根色谱柱可分离不同的用一根色谱柱可分离不同的用一根色谱柱可分离不同的化合物。化合物。化合物。化合物。样品量少，容易回收样品量少，容易回收样品量

23、少，容易回收样品量少，容易回收样品经过色谱柱后不被样品经过色谱柱后不被样品经过色谱柱后不被样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。破坏，可以收集单一组分或做制备。破坏，可以收集单一组分或做制备。破坏，可以收集单一组分或做制备。HPLC的仪器配置的仪器配置色谱泵色谱泵色谱泵色谱泵自动进样器自动进样器自动进样器自动进样器色谱柱及柱温箱色谱柱及柱温箱色谱柱及柱温箱色谱柱及柱温箱检测器检测器检测器检测器数据处理系统数据处理系统数据处理系统数据处理系统溶剂溶剂溶剂溶剂一、高压输液系统一、高压输液系统 高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表梯度洗脱装置和压

24、力表等组成。1.1.溶剂贮存器溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为不锈钢或氟塑料制成，容量为1 1到到2 2 L L，用，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。来贮存足够数量、符合要求的流动相。2.2.高压输液泵高压输液泵 高压输液泵是高效液相色高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，泵的性能好坏直接影谱仪中关键部件之一，泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高压将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色形式连续不断地送入液路系统，使样

25、品在色谱柱中完成分离过程谱柱中完成分离过程。泵应具备的性能：泵应具备的性能：泵应具备的性能：泵应具备的性能：1.1.流量稳定；流量稳定；流量稳定；流量稳定；2.2.流量范围宽：分析型应在流量范围宽：分析型应在流量范围宽：分析型应在流量范围宽：分析型应在0.1-10mL/min0.1-10mL/min范围内连续范围内连续范围内连续范围内连续可调，制备型应能达到可调，制备型应能达到可调，制备型应能达到可调，制备型应能达到100mL/min100mL/min；3.3.输出压力高：一般应能达到输出压力高：一般应能达到输出压力高：一般应能达到输出压力高：一般应能达到150-300kg/cm150-300

26、kg/cm2 2；4.4.液缸容积小液缸容积小液缸容积小液缸容积小:便于清洗和更换流动相；便于清洗和更换流动相；便于清洗和更换流动相；便于清洗和更换流动相；5.5.耐腐蚀耐腐蚀耐腐蚀耐腐蚀,密封性好。密封性好。密封性好。密封性好。高压输液泵，按其性质可分为高压输液泵，按其性质可分为高压输液泵，按其性质可分为高压输液泵，按其性质可分为恒压泵恒压泵恒压泵恒压泵和和和和恒流恒流恒流恒流泵泵泵泵两大类。两大类。两大类。两大类。恒流泵恒流泵恒流泵恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗

27、透无关。粘度和柱渗透无关。粘度和柱渗透无关。粘度和柱渗透无关。恒压泵恒压泵恒压泵恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。就能提供恒定的流量。就能提供恒定的流量。就能提供恒定的流量。泵的使用和维护注意事项泵的使用和维护注意事项防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或

28、其它任防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相

29、不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。时间的情况下。时间的情况下。时间的情况下。泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。终产生漏液。终产生漏液。终

30、产生漏液。输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。否则会使高压密封环变形，产生漏液。否则会使高压密封环变形，产生漏液。否则会使高压密封环变形，产生漏液。流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正

31、响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。常工作。常工作。常工作。3.3.3.3.梯度洗脱装置梯度洗脱装置梯度洗脱装置梯度洗脱装置 等度洗脱：在同一分析周期内流动相组成保持恒定等度洗脱：在同一分析周期内流动相组成保持恒定等度洗脱：在同一分析周期内流动相组成保持恒定等度洗脱：在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适用于组分数目较少，性质差别不大的样品。，适用于组分数目较少，性质差别不大的样品。，适用于组分数目较少，性质差别不大的样品。，适用于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱：梯度洗脱：梯度洗脱：梯度洗脱：就是在分离过程中使两种或两种以上不就是在分离过程中使两种或两种以上不就是在分

32、离过程中使两种或两种以上不就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、从而使流动相的强度、极性、从而使流动相的强度、极性、从而使流动相的强度、极性、pHpHpHpH值或离子强度相应地值或离子强度相应地值或离子强度相应地值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。变化，达到提高分离效果，缩短分析

33、时间的目的。乙腈浓度 80%2%2.26224.24538.07141.04342.88047.95140.757梯度洗脱装置分为两类：梯度洗脱装置分为两类：梯度洗脱装置分为两类：梯度洗脱装置分为两类：一类是一类是一类是一类是外梯度装置外梯度装置外梯度装置外梯度装置（又称低压梯度），流动（又称低压梯度），流动（又称低压梯度），流动（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。需一台泵即可。需一台泵即可。需一台泵即可。另一类是另一类是另一类

34、是另一类是内梯度装置内梯度装置内梯度装置内梯度装置（又称高压梯度），将（又称高压梯度），将（又称高压梯度），将（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混序，注入梯度混合室混序，注入梯度混合室混序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。合，再输至柱系统。合，再输至柱系统。合，再输至柱系统。二、进样系统二、进样系统 进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，进样系统包

35、括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。分离。分离。分离。三、分离系统三、分离系统 分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱是色谱系统的心脏，对色谱柱的要求是柱效色谱柱是色谱系统的心脏，对色谱柱的要求是柱效色谱柱是色谱系统的心脏，对色谱柱的要求是柱效色谱柱是色谱系统的心脏，对色谱柱的要求是柱效高、选择性

36、好、分析速度快等。高、选择性好、分析速度快等。高、选择性好、分析速度快等。高、选择性好、分析速度快等。柱的构造柱的构造柱的构造柱的构造 色谱柱由柱管、压帽、密封圈、筛板、接头、色谱柱由柱管、压帽、密封圈、筛板、接头、色谱柱由柱管、压帽、密封圈、筛板、接头、色谱柱由柱管、压帽、密封圈、筛板、接头、螺丝等组成。螺丝等组成。螺丝等组成。螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，也可采用厚壁玻璃或柱管多用不锈钢制成，也可采用厚壁玻璃或柱管多用不锈钢制成，也可采用厚壁玻璃或柱管多用不锈钢制成，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。石英管，管内壁要求有很高的光洁度。石英管，管内壁要求有很高的光洁度。石

37、英管，管内壁要求有很高的光洁度。色谱柱两端的柱接头有筛板，是烧结不锈钢色谱柱两端的柱接头有筛板，是烧结不锈钢色谱柱两端的柱接头有筛板，是烧结不锈钢色谱柱两端的柱接头有筛板，是烧结不锈钢或钛合金。或钛合金。或钛合金。或钛合金。色谱柱的尺寸规格色谱柱的尺寸规格1.1.1.1.常规分析柱：内径常规分析柱：内径常规分析柱：内径常规分析柱：内径2-5mm,2-5mm,2-5mm,2-5mm,柱长柱长柱长柱长10-30cm;10-30cm;10-30cm;10-30cm;2.2.2.2.窄径柱：内径窄径柱：内径窄径柱：内径窄径柱：内径1-2mm,1-2mm,1-2mm,1-2mm,柱长柱长柱长柱长10-2

38、0cm;10-20cm;10-20cm;10-20cm;3.3.3.3.毛细管柱：内径毛细管柱：内径毛细管柱：内径毛细管柱：内径0.2-0.5mm;0.2-0.5mm;0.2-0.5mm;0.2-0.5mm;4.4.4.4.半制备柱：内径半制备柱：内径半制备柱：内径半制备柱：内径5mm;5mm;5mm;5mm;5.5.5.5.实验室制备柱：内径实验室制备柱：内径实验室制备柱：内径实验室制备柱：内径20-40mm,20-40mm,20-40mm,20-40mm,柱长柱长柱长柱长10-30cm10-30cm10-30cm10-30cm；6.6.6.6.生产制备柱：内径达几十厘米。生产制备柱：内径达

39、几十厘米。生产制备柱：内径达几十厘米。生产制备柱：内径达几十厘米。柱的使用和维护柱的使用和维护1.1.1.1.避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动；避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动；避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动；避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动；2.2.2.2.应逐渐改变溶剂的组成；应逐渐改变溶剂的组成；应逐渐改变溶剂的组成；应逐渐改变溶剂的组成；3.3.3.3.一般来说色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可一般来说色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可一般来说色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可一般来说色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的

40、杂质；以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质；以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质；以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质；4.4.4.4.选择适宜的流动相选择适宜的流动相选择适宜的流动相选择适宜的流动相,以避免固定相被破坏；以避免固定相被破坏；以避免固定相被破坏；以避免固定相被破坏；5.5.5.5.避免将基质复杂的样品直接注入柱内，需要对样品避免将基质复杂的样品直接注入柱内，需要对样品避免将基质复杂的样品直接注入柱内，需要对样品避免将基质复杂的样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或在进样器和色谱柱间连接保护柱。进行预处理或在进样器和色谱柱间连接保护柱。进行预处理或在进样器和色谱柱间连接保

41、护柱。进行预处理或在进样器和色谱柱间连接保护柱。四、检测器四、检测器 检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、灵敏度高，重复性好、线性范围宽、灵敏度高，重复性好、线性范围宽、灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类是在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类是溶质性检测器溶质性检测器溶质性检测器溶质性检测器，它仅对被分离组

42、分的物理或物理化，它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。属于此类检测器的有紫外、荧光、学特性有响应。属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等；另一类是电化学检测器等；另一类是总体检测器总体检测器总体检测器总体检测器，它对试样，它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。属于此类检测和洗脱液总的物理和化学性质响应。属于此类检测器有示差折光检测器等。器有示差折光检测器等。1.1.1.1.紫外吸收检测器紫外吸收检测器紫外吸收检测器紫外吸收检测器 （UVUVUVUV）是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测器。是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测器。是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测器

43、。是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测器。因为大部分常见有机物质和部分无机物质都具有紫外因为大部分常见有机物质和部分无机物质都具有紫外因为大部分常见有机物质和部分无机物质都具有紫外因为大部分常见有机物质和部分无机物质都具有紫外吸收性质，所以该检测器是液相色谱中应用最广泛的吸收性质，所以该检测器是液相色谱中应用最广泛的吸收性质，所以该检测器是液相色谱中应用最广泛的吸收性质，所以该检测器是液相色谱中应用最广泛的检测器，几乎所有液相色谱仪都配置了这种检测器。检测器，几乎所有液相色谱仪都配置了这种检测器。检测器，几乎所有液相色谱仪都配置了这种检测器。检测器，几乎所有液相色谱仪都配置了这种检测器。2

44、.2.2.2.二极管阵列检测器（二极管阵列检测器（二极管阵列检测器（二极管阵列检测器（diode-array detector,DADdiode-array detector,DADdiode-array detector,DADdiode-array detector,DAD）以光电二极管阵列作为检测元件的以光电二极管阵列作为检测元件的以光电二极管阵列作为检测元件的以光电二极管阵列作为检测元件的UV-VISUV-VISUV-VISUV-VIS检测器，检测器，检测器，检测器，它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入它可构成多通道并行工作，

45、同时检测由光栅分光，再入它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的射到阵列式接受器上的射到阵列式接受器上的射到阵列式接受器上的全部波长全部波长全部波长全部波长的信号，然后，对二极的信号，然后，对二极的信号，然后，对二极的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。长的三维谱图。长的三维谱图。长的三维谱图。DADDADDADDAD是是是是HPLCHPLCHPLCHPLC检测技术的重大进展。采用

46、这种检测器检测技术的重大进展。采用这种检测器检测技术的重大进展。采用这种检测器检测技术的重大进展。采用这种检测器可以瞬间实时对流出液进行可以瞬间实时对流出液进行可以瞬间实时对流出液进行可以瞬间实时对流出液进行全光谱检测全光谱检测全光谱检测全光谱检测,使使使使HPLCHPLCHPLCHPLC能提供能提供能提供能提供的信息量大幅度增加。换句话说的信息量大幅度增加。换句话说的信息量大幅度增加。换句话说的信息量大幅度增加。换句话说,在一次色谱操作中在一次色谱操作中在一次色谱操作中在一次色谱操作中,可同时获得吸光值、流出时间和各组分的紫外可同时获得吸光值、流出时间和各组分的紫外可同时获得吸光值、流出时间

47、和各组分的紫外可同时获得吸光值、流出时间和各组分的紫外-可见光可见光可见光可见光谱图在一起的三维谱图谱图在一起的三维谱图谱图在一起的三维谱图谱图在一起的三维谱图,提供既定量又定性的色谱信号。提供既定量又定性的色谱信号。提供既定量又定性的色谱信号。提供既定量又定性的色谱信号。样品池样品池二极管阵列二极管阵列光栅光栅D2/W 灯灯每一组分可在每一波每一组分可在每一波长处得到一吸光度值长处得到一吸光度值多波长检测多波长检测三维色谱图三维色谱图At紫外检测器和紫外检测器和DADDAD检测器的区别：检测器的区别：普通普通普通普通UV-VISUV-VISUV-VISUV-VIS检测器是先用单色器分光，只让

48、特定检测器是先用单色器分光，只让特定检测器是先用单色器分光，只让特定检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流通池。而二极管阵列波长的光进入流通池。而二极管阵列波长的光进入流通池。而二极管阵列波长的光进入流通池。而二极管阵列UV-VISUV-VISUV-VISUV-VIS检测器是检测器是检测器是检测器是先让所有波长的光都通过流通池，然后通过一系列分先让所有波长的光都通过流通池，然后通过一系列分先让所有波长的光都通过流通池，然后通过一系列分先让所有波长的光都通过流通池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测光技术，使所有波长的光在接受器上被检测光技术，使所有波长的光在接受器上

49、被检测光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。3.3.示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器 是目前液相色谱中常用的一种检测器，它可连续是目前液相色谱中常用的一种检测器，它可连续是目前液相色谱中常用的一种检测器，它可连续是目前液相色谱中常用的一种检测器，它可连续检测参比池流动相和样品池中流出物之间的折光指数检测参比池流动相和样品池中流出物之间的折光指数检测参比池流动相和样品池中流出物之间的折光指数检测参比池流动相和样品池中流出物之间的折光指数差值，这一差值和样品的浓度成比例关系。某些不能差值，这一差值和样品的浓度成比例关系。某些不能差值，这一差值和样品的浓度成比例关系。某些不

50、能差值，这一差值和样品的浓度成比例关系。某些不能用选择性检测器检测的组分，如高分子化合物、糖类、用选择性检测器检测的组分，如高分子化合物、糖类、用选择性检测器检测的组分，如高分子化合物、糖类、用选择性检测器检测的组分，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等，可用示差折光检测器检测。脂肪烷烃等，可用示差折光检测器检测。脂肪烷烃等，可用示差折光检测器检测。脂肪烷烃等，可用示差折光检测器检测。4.4.荧光检测器荧光检测器 荧光检测器是一种高灵敏的荧光检测器是一种高灵敏的荧光检测器是一种高灵敏的荧光检测器是一种高灵敏的,选择性检测器选择性检测器选择性检测器选择性检测器,其灵敏度比其灵敏度比其灵敏度比其灵敏度