液相色谱实验基础.ppt

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1、液相色谱基础液相色谱基础本章内容：本章内容：液相色谱发展史液相色谱发展史液相色谱的基本概念液相色谱的基本概念影响峰形扩展的因素影响峰形扩展的因素历史回顾历史回顾1906 -Mikhail Semenovich Tswett(1872-1919)碳酸钙吸附剂石油醚1940s-分配色谱和纸色谱1950s-气相,薄层，凝胶过滤色谱 梯度洗脱色谱1960s-商业高效液相色谱.0NNNNMgCHCH23CH3CH3H C30CH3CH3CH30CH300高效液相色谱 (HPLC)进样口检测器色谱图色谱柱溶剂泵混合器HPLC 结构框图HPLC 结构框图液相色谱类型液相色谱类型Types of Compou

2、ndsSeparatedNeutralsWeak AcidsWeak BasesIonics,Bases,AcidsCompounds Insoluble inWater,Organic IsomersIonicsInorganic IonsHigh MW CompoundsPolymersModeReversed-PhaseIo子n-PairNormal-PhaseIon ExchangeSize ExclusionStationary PhaseC-18,C-8,C-18,C-8Silica,Amino,CyanoDiolAnion or Cation Exchange Polystyre

3、neMobile PhaseWater/OrganicModifiersWater/OrganicIon-Pair ReagentOrganicsAqueous/BufferCounter IonGel Filtration-AqueousGel Permeation-OrganicSilicaResinC-4,C-2化合物类型化合物类型模式模式固定相固定相流动相流动相中性弱酸弱碱反相C18,C8,C4氰基,氨基水/有机改性剂离子、碱性、酸性离对C-18,C-8水/有机的离子对试剂不溶于水的化合物正相硅胶、氨基、腈基、二醇有机物离子型无机离子离子交换阴离子或阳离子交换树脂水/缓冲溶液对离子高分

4、子量化合物聚合物体积排阻聚苯乙烯硅胶凝胶过滤-水性的 凝胶渗透-有机的色谱参数色谱参数Detector ResponseTimeABWWABInjectt0tR(A)tR(B)t =保留时间 t =死时间R W=峰底宽度0 定性和定量定性和定量tR(B)-tR(A)WA+WBR=2tR(B)-tR(A)W1/2A+W1/2B =1.176K=tR-t0t0不同R值的峰重叠R=1.5可以得到基线分离0.40.50.60.70.81.001.25影响影响R值的因素值的因素tW=R=1/4Nx-1xk1+k容量因子选择性柱效容量因子容量因子各组份的容量因子（K）随溶剂洗脱强度的变化增大或缩小增加流动

5、相的洗脱强度，降低了洗脱物的容量因子对于反相色谱，增加10的有机组成等于降低每个色谱峰的K值的1/2 到2/3。溶剂洗脱强度弱溶剂洗脱强度强246810110070030010060%AcetonitrileTime(min.)mAU20001600600080%AcetonitrileTime(min.)mAU100040%Water20%Water246810分离选择性分离选择性改用不同的流动相改变流动相的组成改变流动相pH值改变柱温应用特殊的化学效应改变固定相()改变分离选择性改变分离选择性的方法的方法t 0=1=kkBAAB23AB12AB12=1.641.58=1.04=1.150.

6、85=1.35=0.950.63=1.50kkBA温度对分离选择性温度对分离选择性的影响的影响40 601005Time in Minutes柱效柱效Detector ResponseInjectTime高柱效低柱效扩散h=A+C uBu.HETP BuC.uA线速度A=涡流扩散B=自由分子扩散C=传质阻力范德姆特方程 The Van Deemter Equation+AA=涡流扩散多径扩散仔细填充柱子使用均一的载体线 速 度HETP扩散扩散初始带宽最终带宽扩散扩散BB=自由分子扩散纵向扩散在液相中影响小在低流速中影响大线速度HETP扩散扩散C.uC=传质阻力在低流速下可以降低传质阻力使用小颗

7、粒载体可以降低传质阻力HETP线速度滞流的流动相流动相固定相柱外效应柱外效应样品体积 I.连接管路的体积色谱柱进口设计色谱柱出口设计检测池体积(10 L)II.III.IV.V.降低输出回路响应时间VI.如何提高分离度如何提高分离度通过下述方法增加保留时间:选择合适的分离参数增加色谱柱长度增加固定相浓度通过下述方法降低谱带宽度:使用均一的载体仔细填充柱子选择粒度小的载体优化流速减小进样量降低系统死体积降低输出回路响应时间HPLC 仪器简介仪器简介本章内容：本章内容：流动相及贮液罐流动相及贮液罐 高压输液泵及梯度洗脱装置高压输液泵及梯度洗脱装置进样装置进样装置色谱柱色谱柱检测器检测器色谱数据处理

8、装置色谱数据处理装置l优化流路减小死体积l流路自上而下堆积配置堆积配置手手持持控制器控制器检测器检测器 柱温箱柱温箱自动进样器自动进样器泵泵脱气机脱气机 溶剂柜溶剂柜HP-IB外设(x4)l每个部分有独立的电源l1100各部件均由CAN线连接l检测器与化学工作站之间用 LAN线连接(或用HP-IB连接)l脱气机与泵之间用遥控线连接 (错误信号输出)lBCD板用于外设和读取样品瓶数量连线连线指示灯状态指示灯状态Off(power off)Ready(power on)Not ReadyRunErrorResidentBlink仪器LED状态显示电源开关显示BlackBlackYellowGree

9、nRedYellow blinking6种LED仪器状态：Agilent 1100 泵和在线脱气机泵和在线脱气机Agilent 1100系列泵系列泵,G1310A,G1311A,G1312A,G1354A和和Agilent 1100 系列在线真空脱气装系列在线真空脱气装 置置(G1322A)Agilent 1100系列真空脱气机系列真空脱气机建议建议.l低压混合进行梯度洗脱，提高泵的可靠性能。l提高泵在低流速下的操作性能l用于需要脱氧的检测器性能性能/用途用途l与He脱气相比，更方便，更节省费用。l高性能脱气，避免了烦琐的操作，提高仪器稳定性。l内部延迟体积小，便于快速进行溶剂切换。l4通路系

10、统，操作灵活。l与1100其它组件堆积在一起，用遥控线连接，用于传输错误信号。在线真空脱气机工作原理1 mlSolenoid valveHP 1100 Series On-line Degasser:Influence on Detector Baselineno degassinghelium degassingHP on-line degassingAbsorbency123456789Time (min)Solvent:methanol;UV signal:210 nm溶剂传输系统往复活塞泵(单向阀)Gold SealSapphireInsertRuby BallSpringInsert

11、泵头泵头-单元单元/四元泵四元泵Lock ScrewPump head screwsAgilent 1100系列四元泵系列四元泵G1354A;真空脱气机为标准配置真空脱气机为标准配置!建议建议.l使用2，4，8mm内径的柱子l流量范围从 0.2 到 10 ml/minl应用于研究和常规分析特征特征/优点优点l四通路/低压混合能灵活地进行恒梯度或梯度洗脱。l无需消耗昂贵的He而能进行高性能真空脱气。l自动冲程调节，混合非常均匀，降低基线噪音。l对于高盐流动相，可选择Seal Wash清洗密封垫。Agilent 1100系列四元泵系列四元泵G1354A包括真空脱气机包括真空脱气机溶剂柜溶剂柜真空脱

12、气机真空脱气机 G1322A四元泵四元泵 G1311A四元泵工作原理Authoring Division Name File NameSecurity Notice(if required)Vacuum ChamberMCGVAIVOBVDamperPurge ValveWasteto injection devicefrom solventbottlesMCGV 比例阀AIV 主动阀OBV 单向阀Authoring Division Name File NameSecurity Notice(if required)Vacuum ChamberMCGVAIVOBVDamperWastefro

13、m solventbottlesToWasteSample Loop(Fixed Volume)FromToColumnSampleSyringeLoadInjectToColumnPumpFrom PumpTo Waste手动进样器六通阀六通阀之扎针123456泵色谱柱定量环废液排空INJECT六通阀之装样123456泵色谱柱定量环废液排空INJECTLOAD123456泵色谱柱定量环废液排空六通阀之进样INJECTLOAD123456泵色谱柱定量环废液排空六通阀之小刻度进样一INJECTLOAD手动阀流路连接样品回路废液排空管样品回路到色谱柱来自泵出口手动进样器前视图后视图样品定量管样品定

14、量管固定相结构固定相结构本章内容：本章内容：固定相载体结构正相色谱固定相键合相色谱固定相Typical ColumnSiSiSiSiSiPacking SupportsChemically ModifiedSilica GelOHSiOSiOHOOSiOHOSiOOSiOHPoresSilica GelSurface3CHCH3Si-O-Si-(CH2)17CH3正相 HPLC极性固定相有机流动相传统目前硅胶氧化铝氰基二醇基氨基吸附色谱键合相适用于:同分异构体的分离.在有机/水流动相中不溶化合物的分离.适用于中等极性化合物分离.硅胶柱和氧化铝柱的缺点容易脱尾样品被催化分解不易梯度洗脱含水量要控

15、制正相色谱键合相OSiCH3CyanoOSiCH2()nNH2CH2DiolAmineCNSiCHOHCHCHOOH22CH3(CH )2nSiCH3CH3SiSiCH3CH3Particles of ColumnPackings50mLarge PorousParticles30mPellicularBeads3-10mMicroparticulates2m Active Surface键合相柱优点固定相不易被流动相洗脱无需饱和色谱柱非常容易进行梯度洗脱柱子平衡非常快使用极性范围宽选择性唯一柱容量大溶质不易污染柱子Agilent 1100 柱温箱柱温箱TCC柱温箱的特征及优点柱温箱的特征及优

16、点推荐推荐.l温度控制范围：低于室温1080l保留时间的再现性需要稳定 的温度l如果需要在高于或低于室温 进行分离操作时，需要使用 柱温箱特征特征/优点优点l大空间，可以容纳三根30cm长色谱柱l更换柱子非常方便l降温非常方便l安装柱识别可以记录进样次数l使用切换阀可以进行柱切换(可选)l两个单独的加热区可以分别控制温度l可以进行程序升温l内部死体积小(左侧3L，右侧6L)Agilent 1100 二极管阵列检测器二极管阵列检测器推荐推荐.l 研究及方法开发 l 多波长检测l 峰纯度检查l 峰确认（定性）性能性能/优点优点.l灵敏度高(1x10-5AU)。l 两个灯，波长检测范围宽（19095

17、0 nm）。l1024个二极管 和 1 nm 狭缝。l可变狭缝。l根据不同需要选择流动池。l可以进行自动峰检索。l利用紫外谱图进行峰确认Front Elements-DAD 进口管可以直接连接到色谱柱出口进口管可以直接连接到色谱柱出口氘灯流通池室 钨灯DAD光路钨灯钨灯耦合透镜耦合透镜氘灯氘灯光源透镜光源透镜(消色差透镜消色差透镜)氧化钬滤光片氧化钬滤光片支撑透镜支撑透镜Flow cell光谱透镜光谱透镜光栅光栅阵列阵列狭缝狭缝检测器使用统计检测器使用统计43.0%22.0%10.0%8.0%7.0%5.0%1.0%4.0%UV-VISDADFluorescenceRefractive Ind

18、exElectrochemicalConductivityMass specOthers定性分析定性分析-探索三维立体影像探索三维立体影像 Spectral Acquisition ModeslAll spectralEvery 2nd spectrumlAll in peaklApex+Slopes+BaselineslApex+BaselineslNoneAbsorbanceTimeWavelengthDAD测试功能及诊断测试功能及诊断lDAD自检l暗电流测试l灯强度测试l钬玻璃测试l流通池测试l滤光片测试l波长校正l模拟信号输出测试色谱数据处理装置1.计算机2.色谱工作站溶剂准备：过滤使

19、用HPLC纯溶剂过滤装置真空使用小于 0.5m过滤膜.有机物-Teflon 水-Nylon 66防止固体颗粒损伤仪器或柱头日常维护日常维护溶剂准备溶剂准备 不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器，降低泵的操作性能。遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器的寿命：l使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌。l用滤膜过滤溶剂去除微生物。l每两天更换或过滤溶剂。l避免溶剂瓶直接日照。溶剂脱气溶剂脱气v目的v排除溶解在流动相中的氧气和氮气v脱气方法vHe脱气v真空脱气v回流加热脱气v超声脱气溶剂信息溶剂信息避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂：避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂：l卤化物碱金属溶液和相应的

20、酸溶液。l高浓度的无机酸例如：硝酸和硫酸。l能够形成卤素自由基或酸的氯化试剂及其混合物。l含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂。l在有机溶剂中的有机酸溶液。l含有强络合剂的溶液。l四氯化碳和异丙醇或THF混合液。初始化HPLC泵移走溶剂与系统中的气泡使溶剂组成变化更容易 初始化和平衡初始化和平衡确保分析结果再现性对于反相柱使用510倍柱体积流动相平衡色谱柱柱平衡预柱和保护柱预柱和保护柱从泵来的流动相预柱进样口保护柱分析柱至检测器预柱是针对流动相来保护色谱柱预柱是针对流动相来保护色谱柱保护柱是针对样品来保护色谱柱保护柱是针对样品来保护色谱柱色谱柱保护色谱柱保护 过滤所有的溶剂和样品过滤所有的

21、溶剂和样品 使用保护柱使用保护柱 仪器在使用完毕，要冲洗整个系统，移走系统中缓冲液仪器在使用完毕，要冲洗整个系统，移走系统中缓冲液 柱子在不使用时，两端密封保存柱子在不使用时，两端密封保存 在适当的溶剂中保存柱子在适当的溶剂中保存柱子 注意色谱柱的注意色谱柱的pH值使用范围值使用范围 不要高压冲洗柱子不要高压冲洗柱子 不要高温下过长时间使用硅胶键合相不要高温下过长时间使用硅胶键合相样品准备样品准备样品完全溶解在流动相中样品没有完全溶解过滤样品，确保样品中不含固体颗粒用流动相或比流动相弱的溶剂溶解样品进样量尽量小The Good User下列优良常规实验操作能够最大限度降低维修费用：l清洁的仪器、流动相和样品;进行必要的过滤。l保证溶剂的相溶性。l仪器使用完毕，冲洗整个系统，去掉盐份，防止污染。l对仪器的维护和保养进行记录。