《普通组织化学》PPT课件.ppt

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1、第二章第二章 细胞和组织化学方法细胞和组织化学方法第一节第一节 概念概念组织化学（组织化学（istochemistryistochemistry）是介于组织学、细胞学与生物是介于组织学、细胞学与生物化学之间的边缘学科化学之间的边缘学科,它是在保持组它是在保持组织或细胞基本上不改变其生活状态织或细胞基本上不改变其生活状态时细微结构的条件下采用显微镜对时细微结构的条件下采用显微镜对组织或细胞内的某些化学成分和酶组织或细胞内的某些化学成分和酶活性进行活性进行定性、定位和定量定性、定位和定量研究，研究，以便阐明它们在组织或细胞中存在以便阐明它们在组织或细胞中存在和含量的机能意义。和含量的机能意义。组织

2、化学源于组织学、细胞学和组织化学源于组织学、细胞学和生物化学，又有别于这些学科。生物化学，又有别于这些学科。组织化学与组织学和细胞学的不组织化学与组织学和细胞学的不同在于，同在于，组织学和细胞学组织学和细胞学的着眼点是的着眼点是研究研究组织和细胞形态结构；组织和细胞形态结构；而组织化学的着眼点是研究组织而组织化学的着眼点是研究组织和细胞内的和细胞内的化学组成及其含量化学组成及其含量；生物化学技术生物化学技术中通常是将组织和中通常是将组织和细胞破坏制成均浆，然后进行化学沉细胞破坏制成均浆，然后进行化学沉淀，故其定位性能差；淀，故其定位性能差；而而组织化学技术组织化学技术中是尽可能在组中是尽可能在

3、组织或细胞内原位显示各种化学成分，织或细胞内原位显示各种化学成分，故定位性能好。故定位性能好。生物化学技术中的化学反应是在生物化学技术中的化学反应是在试管内试管内进行的，而组织化学技术中的进行的，而组织化学技术中的化学反应通常是在化学反应通常是在组织切片或涂片组织切片或涂片中中进行的。进行的。组织化学在显微镜下能看到所组织化学在显微镜下能看到所 要检查的化学物质。要检查的化学物质。所看到的不是某种化学物质本所看到的不是某种化学物质本 身，而是该物质在其存在的部身，而是该物质在其存在的部 位经过化学反应后看得见反应位经过化学反应后看得见反应 产物。产物。这种产物所在的位置和数量能这种产物所在的位

4、置和数量能 够代表该物质的位置和数量。够代表该物质的位置和数量。组组织织化化学学的的基基本本原原理理是是在在组组织织切切片片或或细细胞胞内内的的拟拟检检成成分分起起化化学学反反应应。形形成成有有颜颜色色的的终终末末反反应应产产物物，该该产产物物沉沉淀淀在在相相应应成成分分所所在在的的位位置置上上，用用以以研研究究糖糖类类.脂脂类类.蛋蛋白白质质.酶酶类类和和核核酸酸等等物物质质在在组组织织或或细细胞胞内内的的分分布布含量。含量。在在组组织织切切片片或或涂涂片片上上显显示示不不同同的的化化学学物物质质，需需要要采采用用不不同同的的组组织织化学处理程序化学处理程序.就就是是应应用用某某类类方方法法

5、处处理理之之后后所所显显示示出出的的反反应应产产物物，只只能能代代表表相相应应的某类物质而不能代表其他。的某类物质而不能代表其他。原原理理：化化学学试试剂剂+化化学学物物质质-变成变成有色反应产物有色反应产物用显微镜观察其变化者称用显微镜观察其变化者称显微镜细显微镜细胞组织化学胞组织化学，若用电镜观察者称，若用电镜观察者称电电镜细胞组织化学镜细胞组织化学，用免疫技术方法，用免疫技术方法则称则称免疫组织化学或免疫电镜细胞免疫组织化学或免疫电镜细胞化学化学。用细胞和组织化学方法显示细胞用细胞和组织化学方法显示细胞组织结构中各种酶的定性、定位、组织结构中各种酶的定性、定位、定量则称定量则称酶组织化学

6、酶组织化学。TX第第二二节节 细细胞胞和和组组织织化化学学的的基基本本技术技术在在应应用用 组组织织化化学学技技术术显显示示组组织织和和细细胞胞内内化化学学物物质质及及定定位位和和定定量量以以及及代代谢谢状状态时，需要满足以下要求：态时，需要满足以下要求：1、保保持持组组织织和和细细胞胞形形态态结结构构的的良良好好状状态态，以以便便反反应应产产物物的的定定位位精精确确。如如果果形态结构破坏而失真，则定位困难。形态结构破坏而失真，则定位困难。（一一）2、具具备备一一定定的的特特异异性性，以以便便获获取取正确的实验结果。正确的实验结果。（3、具具备备一一定定的的灵灵敏敏性性，以以便便含含量量极极微

7、的物质也能被显示出来。微的物质也能被显示出来。（44、生生成成的的反反应应产产物物必必须须是是有有色色沉沉淀淀，颗颗粒粒微微细细不不溶溶，定定位位于于原原位位。反反应应物物沉沉淀淀的的颜颜色色深深度度与与相相应应物物质质含含量量或或酶酶的的活活性性具具有一定的量效关系。有一定的量效关系。（、5、反反应应产产物物具具有有稳稳定定性性，以以便便于于重重复观察复观察（、（、6、要有重复性。、要有重复性。7、选选择择的的试试剂剂必必须须是是分分析析纯纯，对对被被检检测测物物质质或或酶酶应应无无任任何何影影响响；实实验验所所用用器器皿皿必必须须清清洁洁无无污污染染杂杂质质，使使用用的的蒸蒸馏馏水应为双蒸

8、水。水应为双蒸水。8、为为了了保保证证实实验验的的可可靠靠性性、科科学学性性，防防止止假假阳阳性性的的发发生生，必必须须同同时时作作对对照实验。照实验。一、动物的处死一、动物的处死1、麻醉、麻醉对小动物可将浸有乙醚棉球与小动对小动物可将浸有乙醚棉球与小动物同时密封于玻璃容器。较大动物静脉注射物同时密封于玻璃容器。较大动物静脉注射4%戊巴比妥（戊巴比妥（1ml/kg体重）或腹腔内注射体重）或腹腔内注射20%氨基甲酸乙酯（氨基甲酸乙酯（5ml/kg体重）。体重）。2、空气栓塞、空气栓塞较大动物如兔，用较大空针从耳较大动物如兔，用较大空针从耳静脉将空气一次推入。静脉将空气一次推入。3、颈椎脱臼或断头

9、、颈椎脱臼或断头适用于小动物适用于小动物4、股动物放血、股动物放血将动物麻醉，切开股动脉放将动物麻醉，切开股动脉放血。血。二、取材二、取材所取组织细胞必须越新鲜越好，防止组织变所取组织细胞必须越新鲜越好，防止组织变性、挤压、破碎，组织块不宜太大，光镜标本不性、挤压、破碎，组织块不宜太大，光镜标本不超过超过1cm1cm0.3cm,电镜标本约在电镜标本约在0.5mm左左右，条件允许时应低温操作右，条件允许时应低温操作（04）。）。冰冻切片材料取材后应立即用液氮速冻，冰冻切片材料取材后应立即用液氮速冻，-70或或-40低温冰箱保存。低温冰箱保存。三、三、固定固定 将组织浸入某些化学试剂，使将组织浸入

10、某些化学试剂，使细胞内的物质尽量接近其生活状态细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置，这一过程称时的形态结构和位置，这一过程称为为固定固定。1）、固定的意义）、固定的意义保持细胞与生活时的形态相似，防止自溶与腐败。保持细胞与生活时的形态相似，防止自溶与腐败。保持细胞内特殊的成分与生活状态时相仿：经过保持细胞内特殊的成分与生活状态时相仿：经过固定，细胞内的一些蛋白质等可沉淀或凝固，使固定，细胞内的一些蛋白质等可沉淀或凝固，使其定位在细胞内的原有部位，有利于其后物质的其定位在细胞内的原有部位，有利于其后物质的确切定位，对于不同的物质应选用不同的固定剂确切定位，对于不同的物质应选用不同的固

11、定剂和固定方法。和固定方法。便于区别不同组织成分：组织细胞内的不同物质便于区别不同组织成分：组织细胞内的不同物质经固定后产生不同的折光率，对染料产生不同的经固定后产生不同的折光率，对染料产生不同的亲和力，经染色后容易区别。亲和力，经染色后容易区别。有利于切片：固定剂有硬化作用，使组织硬度增有利于切片：固定剂有硬化作用，使组织硬度增加，便于制片。加，便于制片。2）、固定的要求）、固定的要求既要保持这些物质的精确定位。既要保持这些物质的精确定位。又要保存它们的反应性。又要保存它们的反应性。一般来说，一般来说，新鲜未固定的组织，对于反应性的保持最好，新鲜未固定的组织，对于反应性的保持最好，但形态结构

12、的保存差。可溶性物质易于弥散。但形态结构的保存差。可溶性物质易于弥散。而经过固定的组织，形态结构的保持较好，但而经过固定的组织，形态结构的保持较好，但其反应性却随固定程度而减弱，化学物质易丢其反应性却随固定程度而减弱，化学物质易丢失，特别是酶易失去活性失，特别是酶易失去活性不不同同的的固固定定剂剂和和固固定定方方法法会会引引起起不不同同程程度度的的细细胞胞内内蛋蛋白白质质、粘粘多多糖糖、脂脂类类、核核酸酸和和低低分分子子量量物物质质的的损损失失，因因此此应应根根据据研研究究目目的的的的不不同同选选择择合合适适的的固固定定剂剂和和固固定定方方法法，以使所研究的物质损失达到最小。以使所研究的物质损

13、失达到最小。固固定定液液的的量量要要足足，一一般般应应为为组组织织块块总总体体积积的的45倍倍，而而且且应应在在组组织织取取下下后后立立即即或或尽尽快快放放入入适适当当固固定定液液中中。组组织织块块的的大大小小、固固定时间、固定温度都应考虑。定时间、固定温度都应考虑。3）、固定剂的种类和作用）、固定剂的种类和作用用于固定组织的化学物质称为固定液用于固定组织的化学物质称为固定液或固定剂。或固定剂。1、按组成分类、按组成分类一般由单一化学物质组成者称为固定剂一般由单一化学物质组成者称为固定剂或单纯固定液。由多种化学物质混合组或单纯固定液。由多种化学物质混合组成者称为混合固定液或复合固定液。常成者称

14、为混合固定液或复合固定液。常用的单纯固定液和混合固定液介绍如下：用的单纯固定液和混合固定液介绍如下：甲醛甲醛是一种易挥发液体。市面上出售的为是一种易挥发液体。市面上出售的为40%的甲的甲醛水溶液，也称为福尔马林。一般作为固定剂使醛水溶液，也称为福尔马林。一般作为固定剂使用的用的10%的甲醛，是用水和的甲醛，是用水和40%甲醛（甲醛（9：1）混合而成，实际上是混合而成，实际上是4%甲醛。甲醛。甲醛水溶液渗透能力强。固定均匀，组织收缩小，甲醛水溶液渗透能力强。固定均匀，组织收缩小，但经乙醇脱水后收缩较大。甲醛通过使蛋白质分但经乙醇脱水后收缩较大。甲醛通过使蛋白质分子发生交联而产生固定作用。子发生交

15、联而产生固定作用。重铬酸钾重铬酸钾红色结晶，具有毒性，常用其1%3%水溶液作为固定剂。可以使蛋白质变为不溶性。保持其生活时的状态，对于细胞质的固定较好，并且可固定类脂类物质使其不溶于脂溶剂。苦味酸苦味酸为黄色结晶，是一种强酸，易燃易爆，常用其饱和溶液作为固定剂。能沉淀一切蛋白质，穿透慢，组织收缩明显，但组织无明显硬化。对脂肪为类脂无固定作用。丙酮丙酮为易挥发易燃的无色液体，可与水、醇、氯仿和醚等混合。可使蛋白质沉淀，渗透力强，对核的固定差。广泛用于酶组织化学方法中各种酶的固定。Bouin液是一种常规用于外科活检标本固定的良好固定液。用于固定大多数器官和组织，固定效果好，组织细胞结构完整。细胞核

16、着色鲜明，但细胞质着色较差。配方：饱和苦味酸水溶液：甲醛水溶液：冰醋酸=15：5：1Carnoy液固定胞浆和细胞核，对于染色体固定佳，显示DNA和RNA效果好，也常用于糖原和尼氏体的固定。但不能保存脂类。配方：冰醋酸10ml，氯仿30ml，无水酒精60ml。Zenker液为形态学研究常用的固定液。可用于固定多种组织，使细胞核和细胞质染色较清晰。配方：储存液由重铬酸钾2.5g，升汞5g，蒸馏水100ml组成，用时加入冰醋酸5ml。凝固性固定剂:如乙醇.甲 醇.醋酸和苦味酸等；固定剂分为：非凝固性固定剂:如甲醛、戊二醛、重铬 酸钾和锇酸等。2、按作用分类、按作用分类凝固性固定剂作用:于溶胶状的蛋白

17、质，使其发生凝固并呈海绵状，在石蜡包埋时利于溶化的石蜡的浸入，但易使细胞器特别是线粒体受到破坏和形态改变。非凝固性固定剂的作用:是增加溶胶状蛋白质的粘度，进而使细胞器变成不溶性凝胶状态。这种固定剂对细胞器的结构保持较好，但对包埋剂的浸透增强了阻力。4）、固定液的选择）、固定液的选择1、糖：组织细胞中最常见的多糖是糖原和粘液物质。冷饱和苦味酸的纯酒精溶液加甲醛（9：1）及冷carnoy液，被广泛采用。2、脂类：除含有脂溶剂的固定剂外，其他的固定液均可应用。常用的是甲醛。3 3、核酸：、核酸：凝凝固固性性固固定定剂剂。如如乙乙醇醇和和醋醋酸酸等等。能能有有效效地地保保持持核核酸酸，carnoyca

18、rnoy固固定定液液最最为为常常用用，但但不不宜宜时时间间过过长长。酸酸性性固固定定液液中中固固定定过过久久，会会发发生生核核酸和脱氧核糖核酸被抽提出来。酸和脱氧核糖核酸被抽提出来。4 4、酶：、酶：在在酶酶组组织织化化学学技技术术中中，为为了了增增强强酶酶反反应应的的敏敏感感性性，必必须须高高效效地地保保存存酶酶活活性性。而而为为了了正正确确判判断断反反应应结结果果，则则必必须须使使酶酶反反应应能能在在原原位位进进行行。丙丙酮酮和和乙乙醇醇在在很很大大程程度度上上能能使使酶酶的的反反应应在在原原位位进进行行不不会会发发生生反反应应产产物物的的扩扩散散。冷冷丙丙酮酮和和冷冷乙乙醇醇最最好好。经

19、经甲甲醛醛（固固定定24h24h）固固定定。碱碱性性和和酸酸性性磷磷酸酸酶酶的的活活性也保持较好。性也保持较好。（一）石蜡切片法（一）石蜡切片法：石石蜡蜡切切片片就就是是组组织织经经固固定定、脱脱水水后后包包埋埋在在石石蜡蜡内内，再再切切成成组组织织切切片片可可用用来来显显示示蛋蛋白白质质、氨氨基基酸酸、核核酸酸和和多糖等。多糖等。1.1.脱脱水水：乙乙醇醇取取代代组组织织内内的的水水分，从分，从50%50%低浓度乙醇开始。低浓度乙醇开始。2.2.透明：二甲苯取代组织内的乙醇透明：二甲苯取代组织内的乙醇3.3.浸蜡与包埋：石蜡取代组织内的浸蜡与包埋：石蜡取代组织内的 二甲苯二甲苯（软蜡：（软蜡

20、：454550 50；硬蜡：；硬蜡：55556060）4.4.切片：切片：4 4 10m10m5.5.展片与粘片：将切下的组织蜡片放展片与粘片：将切下的组织蜡片放 入入盛盛有有40 40 左左右右温温水水的的水水槽槽中中，切切片片漂漂浮浮于于水水面面并并因因受受热热而而展展开开。蜡蜡片片即即粘粘于于载载玻玻片片上上，置置入入37 37 烤烤箱箱内内烤烤干干以备反应显色。以备反应显色。（二）与冰冻有关的切片法（二）与冰冻有关的切片法 石石蜡蜡切切片片过过程程较较复复杂杂且且浸浸蜡蜡过过程程中中的的温温度度较较高高，易易引引起起组组织织细细胞胞内内酶酶活活性性降降低低以以及及丧丧失失和和其其它它被

21、被检检成成分分丢丢失失。使使组组织织化化学学反反应应性性降降低低。为为了了克克服服这这个个缺缺点点，获获得得理理想想的的反反应应结结果果，通通常常采采用用与与冰冰冻冻有有关关的的制制片片技技术术，包包括括冰冰冻冻切切片片法法、冰冰冻冻干干燥燥法法和和冰冰冻冻替替代法代法1 1、冰冻切片法：冰冻切片法：恒恒冷冷箱箱切切片片，一一般般可可切切出出3 350m50m厚厚的的切切片片。大大部部分分组组织织在在 -15-15-20-20度度条条件件下下切切片片最最易易成成功功。组组织织块块温温度度过过低低，切切片片易易碎碎。组组织织块块温温度度或或防防卷卷夹夹温温度度高高，切切片片会会因因组组织织潮潮湿

22、湿致粘附在切片刀上。致粘附在切片刀上。1.2 2、冰冻替代法：、冰冻替代法：即即组组织织经经骤骤冷冷后后立立即即置置于于低低温温（-40-40-70-70度度）液液体体脱脱水水剂剂。如如丙丙酮酮中中，使使组组织织中中的的水水被被脱脱水水剂剂替替代代，从从而而既既起起到到组组织织脱脱水水作作用用。可可起起到到组组织织固固定定作作用用。组组织织替替代代脱脱水水后后逐逐渐渐恢恢复复到到室室温温，再再进进行石蜡包埋。行石蜡包埋。此此法法多多用用于于水水解解酶酶。氧氧化化酶酶和和脱脱氧氧酶等的组织化学研究。酶等的组织化学研究。第三节第三节 常用的常用的组织化学组织化学定量术定量术 组织化学是以反应产物做

23、定位和定性研究，以往常用“”号表示，一般分为+五个等级，这种方法没有明确的客观指标，误差较大，特别是对于差别小的样品更无法准确判断。随着生命科学研究的不断深入，定量技术的应用日益广泛，并取得了很大的进展。目前常用以下方法对组织和细胞形态结构及化学成分进行定量研究，以阐明组织和细胞的生长、发育、分化、代谢和功能的变化以及对各种因素的反应。.显微分光光度定量术是应用显微分光光度计对组织和细胞内化学成分进行定量分析的技术。基本原理是细胞内某种物质的含量不同，其染色反应的深浅不一，对一定波长的光吸收也不同，可通过测定其光密度值(OD值)进行定量分析比较。2.图像分析仪 组织化学和免疫组织化学染色、荧光

24、素染色、放射自显影以及原位杂交等标本均可应用图像分析仪测定其光密度值进行定量分析。这些数值以“量”的概念阐述了结构与功能的关系及病理状态下的变化。第四节第四节若干若干组织化学染色原理组织化学染色原理组织学切片所需的组织，除一部分可取自组织学切片所需的组织，除一部分可取自人体外（如外科手术活检组织或尸检的新人体外（如外科手术活检组织或尸检的新鲜材料），大部均取自动物。鲜材料），大部均取自动物。一、脂类显示 脂类物质包括脂肪与类脂。标本可用甲醛固定、冷冻切片、用油红、苏丹、苏丹、苏丹黑B、尼罗蓝等脂溶性染料染色；亦可用饿酸固定兼染色，脂类呈黑色。二、核酸显示法 显示DNA的传统方法为Feulgen

25、反应。切片先经稀盐酸处理后，使细胞内DNA水解，打开DNA分子中脱氧核糖核酸和嘌呤碱之间的连接按键，使其释放出醛基，再用Schiff试剂处理，形成紫红色反应产物。如用甲基绿-派若宁反应，可同时显示细胞内的DNA和RNA甲基绿与细胞核中的DNA结合呈蓝绿色，派若宁与核仁及胞质内的RNA结合呈红色。三、酶类显示 细胞内含有多种酶,每一种酶可催化一定的化学反应。酶的显示法是通过显示酶的活性来表明酶的存在，而不是酶的本身。将具有酶活性的组织放入含有一定底物的溶液中孵育，底物经酶的作用形成初级反应产物，它再与某种捕捉剂相反应,形成显微镜下可视性沉淀,即最终反应产物。如欲显示细胞内酸性磷酸酶,先将切片放入

26、含有酶底物(常用-甘油磷酸钠)的溶液（PH5.0)中孵育，底物经酶的作用，水解并释放出磷酸；用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应，形成微细的磷酸铅沉淀，此时，可在电镜下检出；如再用硫化铵处理时，磷酸铅被置换成硫化铅沉淀，可在光镜下见到。第五节第五节显示多糖的高碘酸显示多糖的高碘酸Schiff(PAS)反应反应1、反应原理：、反应原理：高碘酸是一种强氧化剂，通过高碘酸的氧化作用，打开糖分子结构内乙二醇中的碳-碳（CC）键形成醛基：HOHHOOHH高碘酸OHC-C-CC-形成的醛基与Schiff试剂中无色的亚硫酸品红起反应，生成紫红色化合物沉淀，有此沉淀物的部位即表示有多糖的存在。高碘酸Schiff多糖多糖形

27、成醛基生成紫红色沉淀氧化无色（1）Schiff试剂的配制试剂的配制改良法1）配方:碱性品红1g偏重亚硫酸钠(Na2S2O5)2g浓盐酸2ml蒸馏水200ml活性碳0.3g2)2）配法:将颗粒状的碱性品红研磨成细粉状以便溶解将蒸馏水煮沸，移开酒精灯冷至700C时将碱性品红加入，充分摇动，再让其冷至室温；加入浓盐酸，充分混匀；加入偏重亚硫酸钠，摇动至充分混匀，避光静置24h;加入活性碳，摇动2min,过滤应如水般清亮，无色或微黄色。此滤液即为Schiff试剂，且可立即使用。注：Schiff试剂若暂时储存应将其置于棕色瓶内，并将瓶盛满，不留或少留空间，且用玻璃塞塞紧，以防SO2跑掉。置冰箱内保存备用

28、。（2）Graumaun标准法1）配方：碱性品红或对品红0.5g1N盐酸15ml偏重亚硫酸钠0.5g蒸馏水85ml活性碳0.3g2)配法:将碱性品红或对品红溶于1N盐酸中;将偏重亚硫酸钠溶于蒸馏水中;将液立即加到液中去,充分混匀,但不要摇荡,入紧塞的棕色玻瓶中静置,随后,其红色渐变成浅黄色,静置24h;加入活性碳,摇动2min并过滤,滤液即为Schiff试剂,也应如水般清亮.注:a、注：a、此中Schiff试剂在满装紧塞的棕色玻瓶内可保存数月；b、b、用更强的还原剂，即保险粉Na2S2O5替代偏重亚硫酸钠。在工作过程中，若Schiff试剂泛红，可随意加入极少量的保险粉能立即消除其红色。（3)、

29、0.5%高碘酸溶液的配制高碘酸0.5g蒸馏水100ml将高碘酸溶入蒸馏水内即可.(4)、唾液的收集收集唾液,用2-3层纱布过滤去除其内含的食物残渣即可。（5）染色步骤1、切片脱蜡到水；2、部分切片入唾液内，在370C温箱中孵育1h。唾液中的淀粉酶可将细胞内的糖原水解掉，以作对照试验；3、将经过和未经过的唾液处理的切片同入0.5%高碘酸中氧化5-10min,不可过长,或用4%高碘酸也可;4、水洗。蒸馏水换洗几次，或先用流水冲洗再用蒸馏水摆洗，以洗掉多余的高碘酸；5、入Schiff试剂中浸染1015min;6、流水冲洗1015min，再用蒸馏水洗，以彻底去除多余的Schiff试剂，以免污染其它非糖原成分；7、用苏木素复染细胞核0.5-1min,用自来水冲洗使核发兰(此步可免);8、蒸馏水摆洗;9、常规脱水、透明、封片。（6）染色结果糖原和其它含多糖的结构（如基底膜）呈红色。对照切片不显紫红色。