现代组织化学-组织化学.ppt

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1、现代组织化学技术现代组织化学技术(Modern Histochemical Technology)华中科技大学同济医学院华中科技大学同济医学院 解剖学系组织胚胎学教研室解剖学系组织胚胎学教研室 李宏莲李宏莲 1、经典组织化学经典组织化学 2、免疫组织化学免疫组织化学 3、原位杂交组织化学原位杂交组织化学 现代组织化学的内容现代组织化学的内容组组 织织 化化 学学(也称细胞化学也称细胞化学)（Histochemistry or cytochemistry）一、组织化学的基本概念一、组织化学的基本概念（一）组织化学的提出一）组织化学的提出（二）组织化学的定义（二）组织化学的定义 在保持在保持组织组

2、织或或细胞细胞基本上不改变其生活状基本上不改变其生活状 态时的微细结构的条件下，采用显微镜技术观态时的微细结构的条件下，采用显微镜技术观 察某些察某些化学成分化学成分或或酶活性酶活性在组织或细胞内的在组织或细胞内的定定 性性、定位定位和和定量定量及其变化规律及其变化规律 定性，定位，定性，定位，定量定量;组织原位，显微镜组织原位，显微镜 铅法（铅法（ATP酶）酶）H E染色染色醛复红染色醛复红染色H E染色染色 （三）组织化学的基本原理（三）组织化学的基本原理 化学反应化学反应化学试剂化学试剂+拟检物质拟检物质 反应产物沉淀反应产物沉淀（有色）（有色）（组织切片或细胞涂片）（组织切片或细胞涂片

3、）（拟检物质所在处）（拟检物质所在处）一、组织化学的基本概念一、组织化学的基本概念（四）组织化学技术的用途（四）组织化学技术的用途 一、组织化学的基本概念一、组织化学的基本概念1.某些离子某些离子:钙离子、铁离子、磷酸根离子等2.糖类糖类:过碘酸希父反应（过碘酸希父反应（PAS反应）可以显示多糖和糖蛋白的糖链反应）可以显示多糖和糖蛋白的糖链糖多醛紫红色反应产物过碘酸品红硫酸复合物无色，即希夫试剂（四）组织化学技术的用途（四）组织化学技术的用途 一、组织化学的基本概念一、组织化学的基本概念3.脂类脂类:甲醛固定，冰冻切片，用油红O、尼罗蓝或苏丹类脂溶性染料染色，可呈现相应颜色4.核酸核酸:DNA

4、显示：福尔根反应稀盐酸水解DNA，再用希夫试剂处理，形成紫红色产物DNA和RNA同时显示：甲基绿-派若宁儿茶酚胺、蛋白质、氨基酸等等儿茶酚胺、蛋白质、氨基酸等等5.酶类酶类:通过显示酶的活性来检测酶的存在。常用光镜酶组织化学常用光镜酶组织化学显示法反应原理显示法反应原理酶组织化学基本反应原理 酶特异性底物酶特异性底物 +相关捕获剂相关捕获剂 反应产物沉淀（反应产物沉淀（有色有色）反应产物沉淀（反应产物沉淀（无色无色）+置换剂置换剂酶酶（孵育液内）（孵育液内）（组织细胞内）（组织细胞内）镜下观察镜下观察有色沉淀有色沉淀 R-PO4Na2+H2O R-OH+CaHPO4CaHPO4 Co3(PO4

5、)2Co3(PO4)2 CoS（显色）（显色）1 1、金属、金属-金属盐显示法金属盐显示法 方法方法：钙：钙-钴法钴法CaCl2酶作用酶作用Co(NO3)2(NH4)2S（无色沉淀）（无色沉淀）1 1、金属、金属-金属盐显示法金属盐显示法 方法方法：铅法：铅法R-PO4Na2+H2O R-OH+PbHPO4PbHPO4 PbS（显色）（显色）酶作用酶作用Pb2+(NH4)2S2、偶联偶氮色素法、偶联偶氮色素法I、同时偶联法同时偶联法：该法是该法是孵育液孵育液中的中的底物底物被被酶酶分解后所产生的分解后所产生的反应物沉淀立即与反应物沉淀立即与重氮盐重氮盐形成形成重氮化合物重氮化合物的的偶氮偶氮色

6、素色素而而显色显色。II、后偶联法后偶联法：该法是为了防止该法是为了防止重氮盐重氮盐对对酶酶的抑制作用，而的抑制作用，而先使先使酶酶作用于作用于底物底物，使其分解产生反应物沉淀，使其分解产生反应物沉淀，然后将其浸渍于然后将其浸渍于重氮盐重氮盐溶液中，使其形成溶液中，使其形成偶氮色偶氮色素素而而显色显色。OPO2CaOHOHNNCl-磷酸萘酚磷酸萘酚-萘基氯化重氮盐萘基氯化重氮盐不溶性不溶性偶氮色素偶氮色素N=NOH酶作用酶作用+3、色素形成法、色素形成法I、四唑盐法四唑盐法 是指在是指在孵育液中孵育液中含有含有四唑盐四唑盐或或双四唑盐双四唑盐的的酶作用底物酶作用底物，在在脱氢酶脱氢酶的作用下，

7、的作用下，酶作用底物酶作用底物分离出氢原子，形成分离出氢原子，形成红色或蓝色的色素，即甲红色或蓝色的色素，即甲月月朁朁（cn）或二甲或二甲月月朁朁，它们沉着在酶作用部位，即酶的定位。它们沉着在酶作用部位，即酶的定位。C6H5CNNC6H5NNC6H5酶作用酶作用+2HC6H5CNNHC6H5NNC6H5+HCl四唑盐四唑盐(无色无色)甲甲月朁月朁（红色）（红色）3、色素形成法、色素形成法II、靛酚蓝法：、靛酚蓝法：H3C CH3NNH3C CH3NNH2OH+酶作用酶作用+2H2O二甲基二甲基对对苯二胺苯二胺-萘酚萘酚靛酚靛酚几种酶的反应原理 酸性磷酸酶酸性磷酸酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 三磷酸

8、腺苷酶三磷酸腺苷酶 乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶 细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶 一氧化氮合酶一氧化氮合酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶（ALP）1、反应原理（钙、反应原理（钙-钴法）钴法）R-O-PO3Na2 R-OH+H3PO4 (-甘油磷酸钠甘油磷酸钠)H3PO4+CaCl2 CaHPO4 CaHPO4+Co(NO3)2 Co3(PO4)2 Co3(PO4)2+(NH4)2S CoS(棕黑色棕黑色)2、孵育液孵育液的成分：的成分：3%-甘油磷酸钠甘油磷酸钠 10 ml 2%巴比妥钠巴比妥钠 10 ml 2%CaCl2 20 ml 5%MgSO4 1 ml 双蒸水双蒸水 5 ml ALPpH 9.4 酸

9、性磷酸酶酸性磷酸酶(ACP)1、反应原理（铅法）：、反应原理（铅法）：R-O-PO3Na2 R-OH+H3PO4 (-甘油磷酸钠甘油磷酸钠)H3PO4+Pb2+Pb3(PO4)2 Pb3(PO4)2+(NH4)2S PbS(棕黑色棕黑色)2、孵育液孵育液的成分：的成分：0.05 mol/L 醋酸盐缓冲液（醋酸盐缓冲液（pH 5.0）10 ml 3%-甘油磷酸钠甘油磷酸钠 1 ml 蔗糖蔗糖 0.8 mg 硝酸铅硝酸铅 10 mgACPpH 5.0三磷酸腺苷酶三磷酸腺苷酶(ATPase)1、反应原理（铅法）：、反应原理（铅法）：APP P+H2O APP+H3PO4+能量能量 (ATP钠盐钠盐)

10、H3PO4+Pb2+Pb3(PO4)2 Pb3(PO4)2+(NH4)2S PbS(棕黑色棕黑色)2、孵育液的成分：、孵育液的成分：ATP二钠盐二钠盐 10 mg 0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液（缓冲液（pH 7.2）10 ml 0.1 mol/L MgSO4 2.5 ml 2%Pb(NO3)2 1.5 ml 蔗糖蔗糖 0.8 mg 双蒸水双蒸水 5 mlATPaseMg2+乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶(AChE)1、反应原理（亚铁氰化铜法、反应原理（亚铁氰化铜法）：）：碘化乙酰硫代胆碱碘化乙酰硫代胆碱 +H2O 硫代胆碱硫代胆碱+醋酸醋酸 硫代胆碱硫代胆碱+铁氰化物铁氰化物 亚铁氰化

11、物亚铁氰化物 亚铁氰化物亚铁氰化物+Cu2+亚铁氰化铜亚铁氰化铜(棕褐色棕褐色）2、孵育液孵育液的成分：的成分：碘化乙酰硫代胆碱碘化乙酰硫代胆碱 盐盐 5 mg 0.1 mol/L 醋酸缓冲液（醋酸缓冲液（pH 5.5）6.5 ml 0.03 mol/L(7.5%)CuSO4 1.0 ml 0.1 mol/L(2.94%)枸橼酸钠枸橼酸钠 0.5 ml 0.005 mol/L(0.164%)铁氰化钾铁氰化钾 1.0 ml 双蒸水双蒸水 1.0 mlAChEpH 5.5细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶(CCO)1、反应原理（靛酚法）：、反应原理（靛酚法）：二甲基对苯二胺二甲基对苯二胺 二甲基对苯二胺

12、的侧链氨基氧化二甲基对苯二胺的侧链氨基氧化 侧链氨基氧化的二甲基对苯二胺侧链氨基氧化的二甲基对苯二胺 +-萘酚萘酚 靛酚靛酚(蓝色蓝色）2、孵育液的成分：、孵育液的成分：-萘酚萘酚 纯酒精纯酒精 二甲基对苯二胺二甲基对苯二胺 双蒸水双蒸水 0.1 mol/L 磷酸缓冲液磷酸缓冲液（pH 7.2 7.9）CCOpH 5.5 O2线粒体标志酶线粒体标志酶L-精氨酸精氨酸NADPH（介导介导）一氧化氮合酶一氧化氮合酶（NOS）NOSL-瓜氨酸瓜氨酸 +NO +电子电子电子电子NADPH（传递传递）硝基四唑蓝硝基四唑蓝（N-BT）甲甲月替月替(formazan)1、反应原理（、反应原理（NADPH-d

13、法）：法）：2、孵育液孵育液的成分：的成分：NADPH（还原辅酶）还原辅酶）10 mg N-BT 5 mgTriton X100 0.03 mlTris-HCl缓冲液（缓冲液（pH 8.0）9.97ml二、组织化学标本的制备二、组织化学标本的制备(一一)组织的固定组织的固定1、固定的目的：、固定的目的：（1）保持组织细胞原有的形态结构）保持组织细胞原有的形态结构（2）使组织硬化）使组织硬化2、固定的优、缺点：、固定的优、缺点：优点：使组织细胞的形态结构得到保持优点：使组织细胞的形态结构得到保持 缺点：拟检物质反应性减弱，酶的活性缺点：拟检物质反应性减弱，酶的活性 易受损易受损(一一)组织的固定

14、组织的固定3、常用固定剂、常用固定剂 (1)甲醛甲醛：HCHO 40%甲醛溶液的商品名称为福尔甲醛溶液的商品名称为福尔 马林，马林，10%福尔马林福尔马林常用作固定剂常用作固定剂 多聚甲醛多聚甲醛:（HCHO)n，n=8100 4%多聚甲醛多聚甲醛溶液常用，溶液常用，用磷酸盐缓冲液配制用磷酸盐缓冲液配制 (2)戊二醛戊二醛：C3H10(CHO)2 24%戊二醛溶液，戊二醛溶液，较好的保存细胞的超微结构，但较好的保存细胞的超微结构，但是保存酶活性效果不佳是保存酶活性效果不佳 (3)乙醇乙醇：CH3CH2OH 80%乙醇溶液，乙醇溶液，较好的保存酶活性和糖原，但会使组织较好的保存酶活性和糖原，但会

15、使组织严重收缩和硬化，常与其它固定剂混合使用严重收缩和硬化，常与其它固定剂混合使用 4、固定的方法固定的方法 （一）方法：一）方法：浸泡、浸泡、推注、推注、滴注滴注 （二）（二）滴注滴注步骤：步骤：1 1、开胸、开胸 2 2、暴露心脏、暴露心脏 3 3、自心尖剪开左心室、自心尖剪开左心室 4 4、插入灌流针至主动脉弓、插入灌流针至主动脉弓 5 5、固定灌流针、固定灌流针 6 6、快速注入冲洗液（有时可免）、快速注入冲洗液（有时可免）7 7、先快后慢注入固定液、先快后慢注入固定液 8 8、慢注毕，将动物装入含、慢注毕，将动物装入含 有少量固定液的塑料袋有少量固定液的塑料袋 置置4C4C冰箱内静置

16、冰箱内静置2h2h后取材后取材 1 1、石蜡切片：、石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）组织取材和固定（甲醛）脱水（梯度酒精）脱水（梯度酒精）透明（二甲苯）透明（二甲苯）浸蜡（石蜡）浸蜡（石蜡）包埋（石蜡）包埋（石蜡）切片（石蜡切片机）切片（石蜡切片机）粘片（载玻片）粘片（载玻片）烤片（烤箱）烤片（烤箱）组织化学染色程序组织化学染色程序 （二）组织切片的制备（二）组织切片的制备1 1、石蜡切片：、石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）组织取材和固定（甲醛）脱水（梯度酒精）脱水（梯度酒精）透明（二甲苯）透明（二甲苯）浸蜡（石蜡）浸蜡（石蜡）包埋（石蜡）包埋（石蜡）切片（切片机）切片（切片机）粘片（载玻片）

17、粘片（载玻片）烤片（烤箱）烤片（烤箱）组织化学染色程序组织化学染色程序 （二）组织切片的制备（二）组织切片的制备1 1、石蜡切片：、石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）组织取材和固定（甲醛）脱水（酒精）脱水（酒精）透明（二甲苯）透明（二甲苯）浸蜡（石蜡）浸蜡（石蜡）包埋（石蜡）包埋（石蜡）切片（切片机）切片（切片机）粘片（载玻片）粘片（载玻片）烤片（烤箱）烤片（烤箱）组织化学染色程序组织化学染色程序（二）组织切片的制备（二）组织切片的制备1 1、石蜡切片：、石蜡切片：组织取材和固定组织取材和固定（甲醛）（甲醛）脱水（酒精）脱水（酒精）透明（二甲苯）透明（二甲苯）浸蜡（石蜡）浸蜡（石蜡）包埋（石蜡）

18、包埋（石蜡）切片（切片机）切片（切片机）粘片（载玻片）粘片（载玻片）烤片（烤箱）烤片（烤箱）组织化学染色程序组织化学染色程序 （二）组织切片的制备（二）组织切片的制备1 1、石蜡切片：、石蜡切片：组织取材和固定组织取材和固定（甲醛）（甲醛）脱水（酒精）脱水（酒精）透明（二甲苯）透明（二甲苯）浸蜡（石蜡）浸蜡（石蜡）包埋（石蜡）包埋（石蜡）切片（切片机）切片（切片机）粘片（载玻片）粘片（载玻片）烤片（烤箱）烤片（烤箱）组织化学染色程序组织化学染色程序（二）组织切片的制备（二）组织切片的制备1 1、石蜡切片：、石蜡切片：组织取材和固定组织取材和固定（甲醛）（甲醛）脱水（酒精）脱水（酒精）透明（二甲

19、苯）透明（二甲苯）浸蜡（石蜡）浸蜡（石蜡）包埋（石蜡）包埋（石蜡）切片（切片机）切片（切片机）粘片（载玻片）粘片（载玻片）烤片（烤箱）烤片（烤箱）组织化学染色程序组织化学染色程序（二）组织切片的制备（二）组织切片的制备（二）组织切片的制备（二）组织切片的制备1 1、石蜡切片：、石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）组织取材和固定（甲醛）脱水（酒精）脱水（酒精）透明（二甲苯）透明（二甲苯）浸蜡（石蜡）浸蜡（石蜡）包埋（石蜡）包埋（石蜡）切片（切片机）切片（切片机）粘片（载玻片）粘片（载玻片）烤片（烤箱）烤片（烤箱）组织化学染色程序组织化学染色程序 （二）组织切片的制备（二）组织切片的制备1 1、石蜡切

20、片：、石蜡切片：组织取材和固定组织取材和固定（甲醛）（甲醛）脱水（酒精）脱水（酒精）透明（二甲苯）透明（二甲苯）浸蜡（石蜡）浸蜡（石蜡）包埋（石蜡）包埋（石蜡）切片（切片机）切片（切片机）粘片（载玻片）粘片（载玻片）烤片（烤箱）烤片（烤箱）组织化学染色程序前的处理组织化学染色程序前的处理组织化学染色组织化学染色 （二）组织切片的制备（二）组织切片的制备组织化学染色程序前的处理组织化学染色程序前的处理:脱蜡（二甲苯）脱蜡（二甲苯）纯酒精置换二甲苯纯酒精置换二甲苯 梯度酒精入水梯度酒精入水 组织化学染色程序组织化学染色程序 常规脱水、透明、封片常规脱水、透明、封片 (二二)组织切片制备：组织切片制

21、备：2、恒冷箱切片恒冷箱切片 组织取材和固定或不固组织取材和固定或不固 定定骤冻（液氮，骤冻（液氮，198 198；干冰，；干冰，7878；冻结金属座冻结金属座，3030）切片切片（恒冷箱）（恒冷箱）粘片（载玻片）粘片（载玻片）晾片晾片 组织化学染色程序组织化学染色程序 常规脱水、透明、封片常规脱水、透明、封片 三、组织化学技术的基本要求三、组织化学技术的基本要求 (一一)保持组织和细胞形态结构的良好状态保持组织和细胞形态结构的良好状态 (二二)具备一定的特异性具备一定的特异性 (三三)具备一定的灵敏性具备一定的灵敏性 (四四)生成的反应产物必须是有色沉淀生成的反应产物必须是有色沉淀 (五五)反应产物具有稳定性反应产物具有稳定性 (六六)要有重复性要有重复性。