脲酶的测定方法.pdf

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1、一、脲酶测定（比色法一、脲酶测定（比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶脲酶是对尿素转化起关键作用的酶,它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。它的活性可以用来表示土壤供氮能力。1 1、试剂配制：、试剂配制：（1 1）pH6。7 柠檬酸盐溶液：取 368g 柠檬酸溶于 600mL 蒸馏水中,另取 295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并,用 1N 氢氧化钠将 pH 调至 6。7，并用水稀释至 2L.（2 2）苯酚钠溶液：称取 62。5g 苯酚溶于少量乙醇中,加 2mL 甲醇和 18。5mL丙酮，后用乙醇稀释至 100mL(A

2、 液),保存再冰箱中。称取 27g 氢氧化钠溶于 100mL 水中（B 液），保存于冰箱中。使用前,取 A、B 两液各20mL 混和,并用蒸馏水稀释至 100mL 备用。（3 3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为 0.9,（1.9g 次氯酸钠溶于 1L 水中）溶液稳定。（4 4）10尿素溶液:10g 尿素溶于 100mL 水中。（5 5）N 的标准溶液:精确称取 0。4717g 硫酸铵溶于水稀释至 1L，则得1mL含 0。1mgN 的标液,再将此液稀释 10 倍制成氮工作液（0。01mg/mL）。2 2、操作步骤、操作步骤称取 5土置于 50mL 容量瓶中,加 1mL 甲苯处理，加塞

3、塞紧轻摇 15;往瓶中加入 5mL10尿素液和 10mL 的柠檬酸盐缓冲液(6。7）,仔细混匀。在 37恒温箱中培养 24。然后用热至38的蒸馏水稀释至刻度（甲苯应浮在刻度以上），摇荡,将悬液过滤。取滤液 1mL 置于 50mL 容量瓶中,用蒸馏水稀释至 10mL，然后加入 4mL 苯酚钠溶液，并立即加入 3mL 次氯酸钠溶液，加入每一试剂后，立即将混合物摇匀,20后，将混合物稀释至刻度，在波长 578处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。标准曲线绘制标准曲线绘制:分别取 0、1、3、5、7、9、11、13mL 氮工作液置于 50mL 容量瓶

4、中，加蒸馏水至 20mL,再加 4mL 苯酚钠溶液和 3mL 次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min 后显色，定容。1h 内再分光光度计上于 578nm 处比色。3 3、结果计算、结果计算以以 2424 小时后小时后 1g1g 土壤中土壤中 NHNH3 3N N 的质量（的质量（mgmg）表示脲酶活性（）表示脲酶活性（Ure)Ure)UreUrea aV Vn/mn/m式中：式中：a a 为由标准曲线求得的为由标准曲线求得的 NHNH3 3N N 浓度浓度(mg/mL)(mg/mL)；V V 为显色液体积为显色液体积（50mL50mL）；n n 为分取倍数为分取倍数;m;m 为烘干土重（为烘干土重（g)g)。补充：1）1h 内在（(青定）酚的蓝色在 1h 内保持稳定）在分光光度计上用 1cm 液槽，于 578nm 处将显色液进行比色测定.2)无土对照：不加土样,其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度,整个实验设置一个对照3）无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。每个土样都设此对照。