3.5净化 (2).ppt

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1、3.5 净化净化(cleanup)是指通过物理的或化学的方法去除提取物中对测定有干扰作用的杂质的过程。单残留分析时，净化所用方法与残留分析物的理化特性密切相关。在多残留分析时，净化操作所用方法也比较通用化。任何一个净化方法都必须考虑时间和成本与检测限之间的关系。净化是消去检测背景噪音、降低检测限的有效方法。净化主要是利用分析物与基体中干扰物质的理化特性的差异，将干扰物质的量减少到能正常检测目标残留农药的水平。物理的方法：分配（极性）、沉淀（溶解性）、挥发（挥发性）、以及色谱（极性）；化学的方法：分配（酸-碱性）、浓酸碱（降解作用）、氧化（降解作用）、衍生化（分子改变）等 两相溶剂的分配和吸附层

2、析是用得最多的净化方法 检测限越低，要消除的干扰杂质就越多，净化要求越高 净化常常是多种方法结合使用。一、干扰杂质类型农产品中主要的干扰杂质 类别类别化合物化合物脂脂类类蜡蜡质质、脂肪、油脂、脂肪、油脂色素色素叶叶绿绿素、叶黄素、花青素素、叶黄素、花青素氨基酸衍生物氨基酸衍生物蛋白蛋白质质、肽肽、生物碱、氨基酸、生物碱、氨基酸碳水化合物碳水化合物糖、淀粉、醇糖、淀粉、醇木木质质素素酚酚类类及其衍生物及其衍生物萜类萜类单萜单萜、倍半、倍半萜萜、二、二萜萜等等环环境境污污染物染物各种有机物、各种有机物、矿矿物、硫、多物、硫、多氯联氯联苯、苯、邻邻苯苯二甲酸二甲酸酯酯、碳、碳氢氢化合物等化合物等1.

3、脂类：这是一类由脂肪酸和醇构成的酯或烃类物质，在动植物产品中大量存在。如,花生含49%，鸡蛋含61%等。由于这类物质溶于许多常用有机溶剂，所以易出现在粗提物中。脂肪能被酸碱皂化，然后被酸氧化降解。虽然脂类物质不易挥发，但由于量大，对气相色谱分析也会造成不利，可能堵塞进样口和柱子，改变色谱性能，还会缓慢地降解为易挥发物质干扰检测。2.色素：这是一类结构上没有多大关联的有色化合物，溶于极性较强的溶剂。主要是会对比色和分光光度分析有影响。腐蚀性试剂能使其降解。3.其它杂质：肽类和氨基酸含有氮，常常还含有硫，这对使用N-或S-选择性检测系统就会产生干扰。碳水化合物无色、无挥发、且在有机溶剂中溶解度较低

4、，所以只会对低挥发性和高水溶性农药的分析造成困难。木质素也和碳水化合物差不多，但它可以降解为酚类物质，从而影响某些农药（如氨基甲酸酯类和苯氧羧酸类）的酚类代谢物的分析。有些维生素的理化性质与很多农药的性质很相近，因而也会产生干扰。环境中非农药污染物对农药残留分析有很大的干扰。如，硫对气相色谱分析中电子捕获、电解电导、和火焰光度检测器都有响应。将硫磺误检为艾氏剂（美国）。多氯联苯和邻苯二甲酸酯，它们不仅出现在环境中的污染样品，在实验室内的某些溶剂、塑料管、瓶盖等材料中也可能对样品造成污染。在农药残留研究的早期有将其误检为有机氯农药的例子。二、净化方法1.柱色谱法柱色谱法(column chrom

5、atography)是一种应用最普遍的方法。柱色谱法的基本原理是将提取液中的农药与杂质一起通过一根适宜的吸附柱，使它们被吸附在表面活性的吸附剂上，然后用适当极性的溶剂来淋洗，农药一般先被淋洗出来，而脂肪、蜡质和色素等杂质持留在吸附柱上，从而达到分离、净化的目的。随着高灵敏度检测方法的出现，样品不断微量化，柱色谱净化吸附剂的用量只用23 g，有的只用0.5 g来净化样品，微量色谱柱一般为5 mm粗，淋洗液10 mL左右，达到量少、快速的目的。常用来作净化处理的色谱柱.弗罗里硅土柱弗罗里硅土（Florisil）是农药残留分析净化中最常用的吸附剂，也称硅镁吸附剂，主要由硫酸镁与硅酸钠作用生成的沉淀物

6、，经过过滤、干燥而得。它是一个多孔性的并有很大比表面积的固体颗粒，比表面值达297 m2/g。弗罗里硅土要经过650的高温加热13 h活化处理，才能提高对杂质的吸附能力，而不影响农药的淋洗率。普通商品仅通过110或260温度活化，故应先在650温度下重新加热一次。处理后的弗罗里硅土贮放在干燥器中能维持4 d活性，过期后应在使用前在130加热过夜，国外不少实验室将弗罗里硅土一直保存在130的烘箱中。弗罗里硅土的活性可以通过测定其表面积值来加以控制。Mills提出一种简便的方法测定弗罗里硅土的活性。据估算，认为1 g弗罗里硅土能吸附分子量为200的化合物100 mg，则活性较合适。一般选用月桂酸来

7、作为被吸附的物质测定的具体步骤如下 测定的具体步骤:取2.0000 g弗罗里硅土25 mL三角瓶 130温度下活化处理过夜冷却到室温时 20.0 mL月桂酸溶液塞上塞子，摇荡15 min 移出10 mL月桂酸溶液 125 mL三角瓶 50 mL中性乙醇及3滴酚酞指示剂 0.05 mol/L的氢氧化钠溶液滴定.求出1 g弗罗里硅土吸附月桂酸的mg数，即所谓月桂酸值(lauric acid value)，通常以LA表示。一般应用弗罗里硅土的活性指标 LA110市售的弗罗里硅土 LA值=75116LA值低硫酸钠含量就越高；解决办法：用水洗涤以去除硫酸钠，在650温度下活化5 h，也可以加大用量来达到

8、净化的目的。.氧化铝柱氧化铝价格便宜，也是一种比较重要的吸附剂。有酸性、中性、碱性之分，可根据农药的性质选用。有机氯、有机磷农药用中性或酸性氧化铝。均三氮苯类除草剂则使用碱性氧化铝。最大的特点就是淋洗液用量较少，但一般由于氧化铝的活性比弗罗里硅土要大得多，因而农药在柱中不易被淋洗下来，当用强极性溶剂时，则农药与杂质又会同时被淋洗下来，所以在应用前必须将氧化铝进行去活处理。去活处理：活性氧化铝（中性或酸性），先在130左右温度下活化4 h以上，然后加入相当于510重量的蒸馏水，在研钵中仔细混合，倒入瓶中盖紧，放置过夜使活性一致。.硅胶柱硅胶是硅酸钠溶液中加入盐酸而制得的溶胶沉淀物，经部分脱水而得

9、无定形的多孔固体硅胶。硅胶柱色谱在样品净化中使用很普遍，它能有效地去除糖等极性杂质，特别是它对N-甲基氨基甲酸酯农药不会象在弗罗里硅土或氧化铝中那样不稳定。通常也需活化处理去除残余水分，使用前再加入一定量的水分以调节其吸附性能。由于硅胶的吸附能力与其表面的硅羟基数目有关，一般在活化时温度不宜超过170，以100110为宜。操作时，一般硅胶的量为 550 g，含水量在010%之间，初始用弱极性溶剂淋洗，如戊烷或已烷，洗脱弱极性化合物，然后逐渐增加溶剂的极性，洗脱极性较强的化合物。糖等强极性化合物一般用甲醇等强极性溶剂也难以洗脱下来，可以很方便地去除。.活性炭柱活性炭(active carbon)

10、柱色谱一般很少单独使用，经常与弗罗里硅土及氧化铝按一定比例配合使用；活性炭对植物色素有很强的吸附作用。将活性炭与510倍量的弗罗里硅土和氧化镁及助滤剂Celite 545等混合，用乙腈-苯（1：1）作淋洗剂，能有效地净化许多有机磷农药。2.凝胶色谱净化实质是筛分效应，又称为体积排阻色谱(SEC)。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。1959年，Porath 和Flodin 首次用一种多孔聚合物交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤色谱（GFC)1964年，Moore 制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中

11、的分离，称为凝胶渗透色谱(GPC)凝胶色谱是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。凝胶过滤色谱适用于分析水溶液中的多肽、蛋白质、生物酶、寡聚或多聚核苷酸、多糖等；凝胶渗透色谱用于高聚物，如聚乙烯，聚丙烯等；美国EPA规定，凡是土样（包括淤泥）提取液均要用凝胶渗透色谱(GPC)作净化处理，去除脂肪、聚合物、共聚物、天然树脂、蛋白质、甾类等大分子化合物，以及细胞碎片和病毒粒子等杂质。大分子杂质，在进行GC或L

12、C分析测定时一般不能通过柱子，但由于堵塞进样阀和柱子造成柱子寿命缩短和结果产生偏差，同时其降解物也可能影响到检测器。（1）凝胶色谱的基本原理）凝胶色谱的基本原理凝胶渗透层析是利用多孔的凝胶聚合物将化合物按分子大小选择性分离的机制，即由于大分子化合物不能进入填料粒子的孔内，溶剂淋洗时只能在粒子间隙通过，而小分子化合物能在粒子孔内穿行，二者运行路径的距离不一样，大分子的路径短，最先流出，小分子的路径长，最后流出。这样就能把最先流出的大分子化合物去除而得到净化。农药残留样品净化中最常用的凝胶渗透色谱填料是各种不同孔径大小和粒子大小的苯乙烯-二乙烯苯共聚物（SDVB），如交联聚苯乙烯凝胶（Bio be

13、ads SX-3)，还有交联葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20),通过控制其聚合时的交联度来获得所需孔径的凝胶粒子。由于大多数农药的分子量都在400以下，选择一定孔径的填料就可很容易地去除提取液中分子量在400以上的杂质。淋洗剂 二氯甲烷1:1二氯甲烷-环戊烷1:1乙酸乙酯-环戊烷所选溶剂对待测物要有良好的溶解度，并对凝胶有一定的膨胀力，不能使每克凝胶的膨胀体积超过2.5ml的溶剂不能用于GPC.凝胶色谱技术在农残留分析中的净化应用样品种类农药种类凝胶种类洗脱溶剂肉、蛋、乳有机氯类Bio-beds SX-3乙酸乙酯-环己烷（1：1）有机磷类氨基甲酸酯类拟除虫菊酯类样品种类农药种类凝胶种类

14、洗脱溶剂蔬菜、水果 有机磷类Bio-beds SX-3二氯甲烷-环己烷（15：85）谷物有机磷类Sephadex LH-20乙醇动物脂肪有机氯类Bio-beds SX-3二氯甲烷-己烷（50：50）含油食品有机氯、有机磷农药Bio-beds SX-3二氯甲烷-己烷（50：50）（2）凝胶色谱操作凝胶柱：内径1.52.5cm的玻璃柱，凝胶高度20cm;溶涨 干燥凝胶 注意：溶涨要充分常温下泡1至数天沸水浴中12h装柱 注意要使整个填充柱非常均匀，排除凝胶中的气泡柱均匀性检测 肉眼观察凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡有色大分子可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上

15、柱，观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱中的凝胶填装情况较好，可以使用；如果色带弥散、歪曲，则需重新装柱。上样 注意事项：上样前对样品过滤或离心；流动相与凝胶床刚好平行；样品轻轻沿柱壁加入；冲洗 流速，分段收集洗脱液再生 表层凝胶去掉；NaCl(0.5mol/L)保存凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然后加入适当的抗菌剂，如氯仿、苯酚等，4下保存。如果要较长时间的保存，则要将凝胶洗涤后脱水、干燥，可以将凝胶过滤抽干后浸泡在50的乙醇中脱水，抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱水，至95乙醇脱水后将凝胶抽干。（3）GPC柱的标定柱的标定指

16、确定分离物质的洗脱体积，在净化上指确定杂质和待测物的洗脱体积。主要保持凝胶、溶剂等实验条件不变，只需一次标定。GPC柱的制备33g Bio-Beads SX-3 400ML烧杯搅拌装柱冲气泡标定 包括奶油脂肪溶液的洗脱；有机氯和有机磷农药的洗脱；奶油脂肪溶液中加入农药后的洗脱；150ML二氯甲烷/己烷（50：50）A.脂肪的洗脱 5g加热过滤后的奶油25ML具塞量筒混合 二氯甲烷/己烷（50：50）5ML上GPC柱二氯甲烷/己烷（50：50）收集10份判断前60ML洗脱液包括98%脂肪5%脂肪B.农药的洗脱混合农药标准溶液：1.2g/mL乙硫磷、0.4g/mL二嗪磷、0.4g/mL环氧七氯、0

17、.2g/mL氯硝胺、0.6g/mL狄氏剂。5ml混合液 GPC柱 16份 浓缩 测定二氯甲烷/己烷（50：50）乙硫磷、二嗪磷在5070ml流出氯硝胺在90100ML流出C.脂肪样品中农药的洗脱 去除开始的60ml溶液，收集后面100ml的溶液进行浓缩、测定，回收率：乙硫磷、二嗪磷在80%以上，有机氯在95%以上.3.其他净化方法（1）磺化法 利用脂肪、蜡质等杂质与浓硫酸的磺化作用，生成极性很强的物质而与农药分离。分液液分配磺化法和柱色谱磺化法（2）低温冷冻净化法在低温下，脂肪和蜡质会形成结晶，故而可以将其从溶解度较高的农药提取物中去除。对动植物样品很典型的一个操作步骤就是，用丙酮提取，然后放

18、入70环境，脂类和某些色素就会沉淀出来。此法可以替代多脂肪样品净化中的液-液分配。（3）凝结剂沉淀法适用农药：有机磷、氨基甲酸酯或其他含氮农药凝结剂由氯化铵与磷酸铵按一定比例配制成（4）化学净化法化学净化法是用强酸、强碱将样品基体消解掉，留下农药母体或其可测知降解物的净化方法。这些方法主要是针对稳定的有机氯农药而建立的。例如，毒杀芬、氯丹、艾氏剂、七氯的分析，先用发烟硫酸处理提取物，使脂类和色素物质水解后去除。同样，浓碱也用于脂类的水解（皂化）。有些酶，如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶，可用来降解净化样品中的肽类杂质。多残留分析净化多残留分析净化在农药残留分析的提取与净化时，必须考虑多残留分析的需要。多

19、残留分析样品的净化一般把液液分配和柱色谱当作其“核心”技术。美国FDA把食品分为非脂肪食品和脂肪食品二类进行净化处理 食品中农药多残留分析通用净化方法 食品类型提取溶剂净化非脂肪食品丙酮硅酸镁/MeCl2含水丙酮活性炭/MgO活性炭/硅烷化硅藻土C-18提取柱硅酸镁/混合醚脂肪食品石油醚石油醚/乙腈分配OV-101其它溶剂硅酸镁/混合醚OV-17硅酸镁/MeCl2凝胶渗透氧化铝+硅酸镁三、样品制备效果的确认三、样品制备效果的确认样品制备的效果确认通常是用测定添加回收率的方法进行。即在样品中添加已知量的待测定农药的标准物质，经过样品制备后，以添加标准物质的样品的测定值和空白样品的测定值之差与添加标准物质的量之比即为添加回收率：回收率越接近100%，方法的准确度越高复习1.农产品中主要的干扰杂质有哪些？2.凝胶色谱的净化原理是什么？