食品检验检疫学4食品检验检疫新技术幻灯片课件.ppt

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1、第四章第四章 食品检验检疫新技术食品检验检疫新技术 第一节第一节 免疫学检测技术免疫学检测技术1.1.基本概念基本概念抗原：凡能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，抗原：凡能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，并能与之结合引起特异性免疫反应的物质称并能与之结合引起特异性免疫反应的物质称为抗原。为抗原。抗体：在抗原刺激下产生的，并能与之特异性抗体：在抗原刺激下产生的，并能与之特异性结合的免疫球蛋白。结合的免疫球蛋白。血清学试验：抗原抗体在体外发生的特异性结血清学试验：抗原抗体在体外发生的特异性结合反应、抗原抗体的反应一般都要用血清，合反应、抗原抗体的反应一般都要用血清，故称为血清学试验或血清学反应。故称

2、为血清学试验或血清学反应。精品文档免免疫疫学学检检测测方方法法的的原原理理：是是借借助助抗抗原原和和抗抗体体在在体体外外特特异异性性结结合合后后出出现现的的各各种种现现象象，对对标本中的抗原或抗体进行定量或定性的检测。标本中的抗原或抗体进行定量或定性的检测。精品文档可以作为抗原进行检测的物质分为以下四可以作为抗原进行检测的物质分为以下四类：类：各种微生物及其大分子产物；各种微生物及其大分子产物；生物体内各种大分子物质；生物体内各种大分子物质；人和动物细胞的表面分子；人和动物细胞的表面分子；各种半抗原物质。各种半抗原物质。精品文档酶酶联联免免疫疫吸吸附附试试验验是是在在免免疫疫酶酶技技术术的的基

3、基础础上上发发展展起起来来的的一一种种新新型型的的免免疫疫测测定定技技术术，其其基基本本原原理理是是抗抗体体（抗抗原原）与与酶酶结结合合后后，仍仍能能和和相相应应的的抗抗原原（抗抗体体）发发生生特特异异性性反反应应，将将待待检检测测样样品品事事先先吸吸附附在在固固相相载载体体表表面面称称为为包包被被；加加入入酶酶标标抗抗体体（抗抗原原），酶酶标标抗抗体体（抗抗原原），与与吸吸附附在在固固相相载载体体上上的的相相应应的的抗抗原原（抗抗体体）发发生生特特异异性性反反应应，形形成成酶酶标标记记的的免免疫疫复复合合物物，不不能能被被缓缓冲冲液液洗洗掉掉；当当加加入入酶酶的的底底物物时时，底底物物发发生

4、生化化学学反反应应，呈呈现现颜颜色色变变化化，颜颜色色的的深深浅浅与与待待测测抗抗原原或或抗抗体体的的量量相相关关，借借助助分分光光光光度度计计的的吸吸光光度度计计算算抗抗原原（抗抗体体）的的量量，也可用肉眼定性观察。也可用肉眼定性观察。精品文档抗抗原原抗抗体体的的特特异异性性和和敏敏感感性性，使使得得食食品品在在未未经经分分离离提提取取的的条条件件下下，即即可可进进行行定定量量和和定定性性分分析析，而而一一般般的的化化学学分分析析都都需需要要经经过过分分离离提提取取等等复复杂杂过过程程。近近年年来来，该该项项技技术术主主要要用用于于细细菌菌及及毒毒素素、真真菌菌及及毒毒素素、病病毒毒和和寄寄

5、生生虫虫的的检检测测；用用于于蛋蛋白白质质、激激素素、其其他他生生理理活活性性物物质质、兽兽药药残残留留、农农药药残残留留、抗抗生生素素等等的的检检测。测。精品文档第二节第二节 核酸提取方法与探针技术核酸提取方法与探针技术样品增菌后的核酸提取方法：样品增菌后的核酸提取方法：热裂解法热裂解法反复冻融法反复冻融法酶裂解法酶裂解法微波法微波法化学裂解法化学裂解法超声破碎法超声破碎法精品文档样品无需增菌的核酸提取方法：样品无需增菌的核酸提取方法：IMSIMS法（免疫磁珠法）法（免疫磁珠法）FTAFTA滤膜吸附法滤膜吸附法精品文档病毒核酸的提取：病毒核酸的提取：异异硫硫氰氰酸酸胍胍-SiO2-SiO2法

6、法：异异硫硫氰氰酸酸胍胍可可以以裂裂解解细细胞胞壁壁，并并灭灭活活核核酸酸酶酶，释释放放出出来来的的核核酸酸被被经经处处理理的的SiO2SiO2所所吸吸附附，从而达到纯化目的。从而达到纯化目的。Glycine-PEG-Tri-reagent-poly(dT)Glycine-PEG-Tri-reagent-poly(dT)法法：通通过过调调节节PHPH和和PEGPEG沉淀核酸，再用沉淀核酸，再用poly(dT)poly(dT)纯化核酸。纯化核酸。精品文档探针的标记物分类：探针的标记物分类：放射性同位素放射性同位素非放射性标记物：是通过酶促反应将特定的非放射性标记物：是通过酶促反应将特定的底物转变

7、为声色物质或化学发光物而达到放大底物转变为声色物质或化学发光物而达到放大信号的目的。常用的标记物金属、荧光染料、信号的目的。常用的标记物金属、荧光染料、地高辛、生物素和酶等，可通过酶促反应、光地高辛、生物素和酶等，可通过酶促反应、光促反应或化学修饰等方法标记到核酸分子上。促反应或化学修饰等方法标记到核酸分子上。探针技术探针技术精品文档探针的标记方法：探针的标记方法：缺口平移法缺口平移法随机引物法随机引物法末端标记法末端标记法PCRPCR标记法标记法精品文档第三节第三节 PCR PCR检测技术检测技术PCRPCR即聚合酶链反应的简称。即聚合酶链反应的简称。PCR PCR是在体外是在体外模拟模拟D

8、NADNA复制的过程，在体外合适的条件下以复制的过程，在体外合适的条件下以单链单链DNADNA为模板，以人工设计和合成的寡核苷为模板，以人工设计和合成的寡核苷酸为引物，利用热稳定的酸为引物，利用热稳定的DNADNA聚合酶延聚合酶延5-35-3方向渗入单核苷酸来特异性的扩增方向渗入单核苷酸来特异性的扩增DNADNA片段的片段的技术。整个反应过程通常由技术。整个反应过程通常由20-4020-40个个PCRPCR循环组循环组成，每个循环由变性、退火、延伸三个步骤组成，每个循环由变性、退火、延伸三个步骤组成。成。精品文档PCRPCR的种类：的种类：（1 1）多重）多重PCRPCR（2 2）免疫）免疫P

9、CRPCR（3 3）PCR-SSCP PCR-SSCP分析技术分析技术（4 4）实时荧光定量）实时荧光定量PCRPCR（5 5）反转录）反转录PCRPCR（6 6）不对称）不对称PCRPCR（7 7）反向）反向PCRPCR精品文档PCRPCR检测技术的应用：检测技术的应用：（1 1）检测产单核细胞李斯特菌）检测产单核细胞李斯特菌（2 2）检测金黄色葡萄球菌）检测金黄色葡萄球菌（3 3）检测沙门氏菌）检测沙门氏菌（4 4）检测致泻大肠杆菌）检测致泻大肠杆菌精品文档第四节第四节 基因芯片技术基因芯片技术基因芯片又称基因芯片又称DNADNA微阵列，是指由按微阵列，是指由按照预定位置固定在固相载体上很

10、小面积照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所构成的微点阵阵内的千万个核酸分子所构成的微点阵阵列。在一定条件下，载体上的核酸分子列。在一定条件下，载体上的核酸分子可以与来自样品的互补核酸片段杂交。可以与来自样品的互补核酸片段杂交。如果把样品中的核酸点段进行标记，在如果把样品中的核酸点段进行标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。信号。基因芯片技术可以应用于转基因食品基因芯片技术可以应用于转基因食品的检测中。的检测中。精品文档基因芯片的分析步骤基因芯片的分析步骤(1)(1)样品活化样品活化(2)(2)靶靶DNADNA的选择的选择(3)PCR

11、(3)PCR扩增扩增(4)(4)玻片的活化玻片的活化(5)(5)芯片的制备芯片的制备(6)(6)杂交杂交(7)(7)洗涤洗涤(8)(8)扫面玻片和数据处理扫面玻片和数据处理 精品文档检测转基因食品基因芯片的制备方法：检测转基因食品基因芯片的制备方法：选选择择目目的的片片段段 根根据据食食品品原原料料来来源源的的具具体体情情况况选选择择不不同同基基因因或或其其片片段段作作为为检检测测对对象象，分分别别设设计计扩扩增增引引物物，PCRPCR扩扩增获得探针，将探针纯化，浓缩后点样于固相支持物上。增获得探针，将探针纯化，浓缩后点样于固相支持物上。转基因食品转基因食品DNADNA的提取的提取目的片段的扩

12、增和标记目的片段的扩增和标记杂交和洗涤杂交和洗涤杂杂交交结结果果的的检检测测：以以基基因因芯芯片片扫扫描描仪仪在在一一定定波波长长进进行行扫扫描检测。描检测。精品文档第五节第五节 生物传感器生物传感器 生物传感器由一种含有固定化生生物传感器由一种含有固定化生物活性物质（如酶、抗体、全细胞、物活性物质（如酶、抗体、全细胞、细胞器或其他联合体）做敏感元件，细胞器或其他联合体）做敏感元件，配上适当的换能器所构成的分析工配上适当的换能器所构成的分析工具（或分析系统）称为生物传感器。具（或分析系统）称为生物传感器。它可将生化信号转化为数量化的电它可将生化信号转化为数量化的电信号。信号。精品文档 生物传感

13、器一般由两个主要部分组成：一是生物生物传感器一般由两个主要部分组成：一是生物分子识别元件（感受器），是具有分子识别能力的生分子识别元件（感受器），是具有分子识别能力的生物活性物质（如酶、抗体、组织切片、细胞、细胞器、物活性物质（如酶、抗体、组织切片、细胞、细胞器、细胞膜、核酸、有机物分子等）；二是信号转换器细胞膜、核酸、有机物分子等）；二是信号转换器（换能器）主要有电化学电极、光学检测元件、热敏（换能器）主要有电化学电极、光学检测元件、热敏电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共振元件等。振元件等。当待测物与分子识别元件特异性结合后，所产生当

14、待测物与分子识别元件特异性结合后，所产生的复合物通过信号转换器转变为可以输出的电信号、的复合物通过信号转换器转变为可以输出的电信号、光信号等，从而达到分析检测的目地。光信号等，从而达到分析检测的目地。精品文档生物传感器的工作原理生物传感器的工作原理（1 1）将化学变化转变成电信号）将化学变化转变成电信号（2 2）将热变化转换成电信号）将热变化转换成电信号（3 3）将光信号转变为电信号）将光信号转变为电信号（4 4）直接产生电信号形式）直接产生电信号形式精品文档常见的生物传感器及其应用常见的生物传感器及其应用酶酶传传感感器器：酶酶传传感感器器是是由由固固定定化化酶酶和和电电化化学学器器件件构构成

15、成，通通过过电电极极反反应应检检测测出出与与酶酶反反应应有有关关的的物物质质，并并转转换换为为电电信信号号，从从而而检检测测试试液液中中的的特特定定成成分分的的浓浓度度。酶酶传传感感器器是是间间接接型型传传感感器器，他他不不是是直直接接测测量量待待测测物物质质，而而是是通通过与反应有关的物质间接地测量待测物质。过与反应有关的物质间接地测量待测物质。精品文档常见的生物传感器及其应用常见的生物传感器及其应用组组织织感感器器：是是以以动动植植物物组组织织薄薄片片中中的的生生物物催催化化层层与与基基础础敏敏感感膜膜电电极极结结合合而而成成，该该催催化化层以酶为基础，基本原理与酶传感器相同。层以酶为基础

16、，基本原理与酶传感器相同。精品文档常见的生物传感器及其应用常见的生物传感器及其应用微微生生物物传传感感器器 微微生生物物传传感感器器由由包包括括微微生生物物的的膜膜状状感感受受器器和和电电化化学学换换能能器器组组合合而而成成，可可以以分分为为：以以微微生生物物呼呼吸吸活活性性（氧氧消消耗耗量量）为为指指标标的的呼呼吸吸活活性性测测定定型型传传感感器器，以以微微生生物物的的代代谢谢产产物物（电电极极活活性性物物质质）为为指指标标的的电电极极活活性性物物质质测测定型传感器。定型传感器。微微生生物物传传感感器器在在食食品品工工业业和和环环境境检检测测中中均均有应用。有应用。精品文档免免疫疫传传感感器

17、器：利利用用抗抗体体能能够够识识别别抗抗原原并并和和被被识识别别抗抗原原结结合合的的功功能能，借借此此开开发发的的生生物物传传感感器器为为免免疫疫传传感感器器。免免疫疫传传感感器器是是以以免免疫疫测测定定法法的的原原理理为为基基础础构构成成的的，可可分分为为标标识识免免疫疫方方式式和和非非标标识识免免疫疫方方式式。可可以以识识别别肽肽或或蛋蛋白白质质等高分子之间微小的结构差异。等高分子之间微小的结构差异。免疫传感器的应用：免疫传感器的应用：（1 1）检检测测食食品品中中的的毒毒素素 毒毒素素的的检检测测主主要要集集中中在在伏伏马马菌菌素素、葡葡萄萄球球菌菌肠肠毒毒素素、黄黄曲曲霉霉毒毒素素、肉

18、肉毒毒毒毒素素等等上上，所用传感器大多数采用光纤免疫传感器。所用传感器大多数采用光纤免疫传感器。（2 2）检检测测食食品品中中的的细细菌菌 以以电电化化学学为为基基础础的的免免疫疫传传感感器已成功用于检测细菌毒素蛋白质。器已成功用于检测细菌毒素蛋白质。精品文档DNADNA生生物物传传感感器器 DNADNA生生物物传传感感器器包包括括两两部部分分，分分子子识识别别器器件件（DNADNA）和和换换能能器器。其其设设计计原原理理是是在在电电极极上上固固定定一一条条含含有有十十几几至至上上千千条条核核苷苷酸酸的的单单链链DNADNA，通通过过DNADNA分分子子杂杂交交，对对另另一一条条含含有有互互补补碱碱基基序序列列的的DNADNA进进行行识识别别，结结合合成成双双连连DNADNA。杂杂交交反反应应在在敏敏感感元元件件上上直直接接完完成成，换换能能器器能能将将杂杂交交过过程程所所产产生生的的变变化化转转变变成成电电信信号号。根根据据杂杂交交前前后后电电信信号号的的变变化化量量，推推测测出出被被检检测测的的DNADNA量。量。DNADNA生生物物传传感感器器的的应应用用：应应用用于于细细菌菌病病、病病毒毒病病、中毒病、肿瘤病等疾病的检测方面。中毒病、肿瘤病等疾病的检测方面。精品文档