《子克隆的载体》PPT课件.ppt

《《子克隆的载体》PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《子克隆的载体》PPT课件.ppt（182页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、第三章第三章 分子克隆的载体分子克隆的载体质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征n载体的定义载体的功能及特征将外源DNA或基因携带入宿主细胞的工具称为载体(vector)n载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件n载体的特征l分子较小，可携带比较大的DNA片段。l能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。l要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点multiplecloningsites，MCS）。l有合适的选择标记，易于筛选。

2、l有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。l从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。n基因克隆利用重组DNA技术分离目的基因，称为基因克隆(geneclone)克隆(clone)动词：指从单一祖先产生同一的DNA分子群体或细胞群体的过程。名词：指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的群体。n基因文库genelibrary由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体，称为基因文库(genelibrary)功能功能克隆载体克隆载体:克隆一个基

3、因或克隆一个基因或DNADNA片段片段表达载体表达载体:用于一个基因的蛋白表达用于一个基因的蛋白表达整合载体整合载体:把一个基因插入到染色体把一个基因插入到染色体组中组中载体的分类载体的分类来源：来源：质粒载体质粒载体plasmidplasmid 噬菌体载体噬菌体载体phagephage 柯斯质粒载体柯斯质粒载体cosmidcosmid 真核细胞克隆载体真核细胞克隆载体载体的种类和特征载体的种类和特征载体种类受体细胞结构插入片断举例质粒*E.coli环状8*pUC18/19,T-载体pGEM-3z等噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系列，gt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状10k

4、bM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli环状300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli环状100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳类细胞线性染色体1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体，昆虫杆状病毒载体穿

5、梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒第一节第一节 质粒（质粒（plasmid）载体）载体l质粒是一种独立于染色体外的遗传因子，可自身复质粒是一种独立于染色体外的遗传因子，可自身复制和表达（但依赖于宿主编码的酶和蛋白质）制和表达（但依赖于宿主编码的酶和蛋白质）一、质粒的基本特征质粒的基本特征l大多数为超螺旋的双链共价闭合环状分子大多数为超螺旋的双链共价闭合环状分子DNA (coverlentlyclosedcircleDNA,cccDNA),少数为线性少数为线性l大小为大小为1-200kb1-200kb，也有更大，也有更大1.质粒的基本概念质粒的基本概念l常见于原核细菌和真菌

6、中常见于原核细菌和真菌中 一、质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的表型质粒的表型：抗生素的抗性，产生抗生素、降解复：抗生素的抗性，产生抗生素、降解复杂有机化合物、产生毒素（如大肠杆菌素、肠毒素）杂有机化合物、产生毒素（如大肠杆菌素、肠毒素）、合成限制性内切酶和修饰酶、生物固氮和杀虫等、合成限制性内切酶和修饰酶、生物固氮和杀虫等克隆克隆的的质粒载体质粒载体 允许外源的允许外源的DNADNA插入，储存。主要是插入，储存。主要是DNADNA水平上的操作。水平上的操作。基因表达的质粒载体基因表达的质粒载体 允许外源允许外源DNADNA的插入、的插入、储存和表达。储存和表达。质粒DNA的构型：SC型共价闭

7、合环形DNA（cccDNA）OC型开环DNA（opencircularDNA,ocDNA）L型线性DNA（linearDNA,LDNA）作为载体的质粒都含有三种共同的组分：复制基因（replicator）选择性记号 克隆位点 LOCSC2.质粒的基本特征质粒的基本特征1）质粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：松弛型复制控制的质粒10-60拷贝relaxedplasmid严紧型复制控制的质粒 1-3 拷贝 stringentplasmid2 2

8、）质粒的不相容性）质粒的不相容性plasmidsincompatibility是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在第二个质粒导入后，在不涉及在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时出现的现限制系统时出现的现象。象。质粒的不相容性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞

9、中复制时，于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。不相容群不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子。在大肠杆菌中现已发现具有相同的复制子。在大肠杆菌中现已发现30多个不相多个不相容群，如容群，如ColE1和和pMB1，pSC101和和p15A。AB3 3）质粒的可转移性）质粒的可转移性transferring在自然

10、条件下，很多在自然条件下，很多质粒可通过称为细菌接合质粒可通过称为细菌接合（conjugation）的作用转移到新的宿主细胞内。）的作用转移到新的宿主细胞内。要素：要素：移动基因mob，转移基因tra，顺式因子bom 及其内部的转移缺口位点nic。4）携带特殊的遗传标记）携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这是寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义标记基因标记基因markergene选择标记基因选择标记基因selectivemark

11、ergene用于鉴别目标用于鉴别目标DNADNA的存在，将成功转化了质粒的宿的存在，将成功转化了质粒的宿主挑选出来主挑选出来抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记 氨苄青霉素抗性基因（Ampicillinresistancegene,ampr）四环素抗性基因（Tetracyclineresistancegene,tetr）氯霉素抗性基因（chloramphenicolresistancegene,Cmr,cat）卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycinresistancegene,kanr,neor）琥珀突变抑制基因 supF在基

12、因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称这样的突变为赭石突变（突变为UAA），或琥珀突变（突变为UAG），或乳白突变（突变为UGA）。supF基因编码细菌的抑制性tRNA，可在UAG密码子上编译酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突变的tetr基因和ampr基因，只有当宿主含有supF基因时才会对Amp和Tet具有抗性。正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。如蔗糖致死基因SacB，来自淀粉水解芽胞杆菌（Bacillusamyloliquefaciens），编码果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培养基上sacB 基因的表达对大肠杆菌来说是致死

13、的，因此该基因可用于插入失活筛选重组子。筛选标记基因筛选标记基因主要用来区别主要用来区别重组质粒与非重组质粒重组质粒与非重组质粒，当一个外，当一个外源源DNA片段插入到一个质粒载体上时，可通片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。组质粒。uu-互补互补uu插入失活插入失活-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶（-galactosidase，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。-互补是基于在两个不同的缺陷-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。

14、uu-互补互补lacZ 基因是乳糖lac操纵子中编码-半乳糖苷酶的基因，乳糖及其衍生物可诱导其表达。乳糖既是lac 操纵子的诱导物，也是作用的底物。IPTG：异丙基-D-硫代半乳糖苷，乳糖的衍生物，可作为lac 操纵子的诱导物，但不能作为反应的底物；X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷，可作为lac 操纵子的底物，但不能作为诱导物。X-gal可作生色剂，被-半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色。乳糖操纵子乳糖操纵子(lacoperon)的结构的结构调控区调控区调节基因调节基因启动序列启动序列操纵序列操纵序列结构基因结构基因Z：-半乳糖苷酶半乳糖苷酶Y：透酶透酶A

15、：乙酰基转移酶：乙酰基转移酶ZYAOPDNA功能互补uu插入失活插入失活通过插入失活进行筛选的质粒主要有pBR322，该质粒具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两种抗性标记。当外源DNA片段插入tetr基因后，导致tetr基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。二、质粒载体的种类质粒载体的种类1.pBR322之前之前2.天然质粒：天然质粒：没有经过以基因克隆为目标没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。的体外修饰改造的质粒。在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天

16、然质粒有然质粒有EolE1、RSF2124和和pSC101等，等，但存在一定的局限性。但存在一定的局限性。分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等转化效率与质粒大小成反比，质粒15kb，转化效率成为限制因素质粒越大，越难用限制性酶切进行鉴定。质粒越大，拷贝数越低2.pBR322之后之后调整载体的结构，提高载体的工作效率调整载体的结构，提高载体的工作效率pBR322pUC系列质粒系列质粒去掉多余片段，提供多克隆位点，筛选标去掉多余片段，提供多克隆位点，筛选标记记增加辅助功能，表达载体（增加辅助功能，表达载体（expressionvector），穿梭载体（），穿梭载体（shuttlev

17、ector）3.克隆载体1）pBR322质粒载体松弛型复制氯霉素可扩增拷贝数50-100/cell用于基因克隆以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子，可通过插入失活来进行筛选2）pUC18/19质粒载体来自来自pBR322拷贝数拷贝数2000-3000/cell用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记正选择颜色标记lacZ -互补互补3）pUC118/119质粒载体由pUC18/19增加了一些功能片段改造而来，大小为3162bp，相当于在pUC18/19中增加了

18、带有M13噬菌体DNA合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。用途：制备单链DNA用于:DNA序列测定、定点诱变、制备探针4）pGEM-3Z/4Z质粒载体由pUC18/19增加了一些功能片段改造而来，大小为2.74kb与pUC18/19相比，在多克隆位点的两端添加了噬菌体的转录启动子，如Sp6和T7噬菌体的启动子。pGEM-3Z和pGEM-4Z的差别在于二者互换了两个启动子的位置。用途：体外转录得到RNA，用于体外蛋白质的合成或用作克隆邻近DNA片段的探针5）多功能质粒载体在上述载体的基础上，人们设计出一些多功能的质粒载体，这类质粒载体综合了以上质粒的特点。除了作为质粒载体基本

19、要素外，综合了上述功能要素，如多克隆位点、-互补、噬菌体启动子和单链噬菌体的复制与包装信号。典型的这类质粒有 pBluescriptKS（），这类质粒一般由 4 个质粒组成一套系统，其差别在于多克隆位点方向相反（根据多克隆位点两端 Kpn 和 Sac 的顺序，用 KS 或 SK 表示），或单链噬菌体的复制启始方向相反（或者说，引导 DNA 双链中不同链合成单链 DNA，用+或-表示）4.表达载体expressionvector该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添了强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件，如PET系列载体。详细情况见后文第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载

20、体phagevectors头部尾管尾锥尾丝C、B、D、E分别指相应基因编码的颗粒蛋白一、噬菌体的分子生物学噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。基因组 双链 DNA 分子，实际大小为 48502bp 在噬菌体颗粒内，基因组 DNA 呈线性，其两端的 5末端带有 12 个碱基的互补单链（粘性末端）当 噬菌体 DNA 进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子，而后在宿主细胞的 DNA 连接酶和旋促酶（gyrase）作用下，形成封闭的环状 DNA 分子，充当转录的模板此时，噬菌体可选择进入裂解生长状态（lyticgrowth），大量

21、复制并组装成子代噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解。经过 4045min 的生长循环，释放出约 100 个感染性噬菌体颗粒（每个细胞）或者进入溶源状态（lysogenicstate），将噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主的染色体 DNA 中，并随宿主的繁殖传给子代细胞感染周期/溶原溶源阶段溶源阶段(整合到寄主整合到寄主染色体上染色体上)裂解阶段裂解阶段 (复制和释放复制和释放)噬菌体基因组至少可编码 30 个基因，它们的分布和排列与其功能有一定关系根据执行功能的不同可将基因组分为三个区：左边区域包括从基因 Nu1 到基因 J 之间的基因，其产物用于噬菌体 DNA 的包装和噬菌体颗粒的

22、形成。中间区域（基因 J 右边至 gam）编码基因调节、溶源状态的发生和维持以及遗传重组所需要的基因。其中许多基因对裂解生长是非必须的，在构建载体时可以去掉，用外源 DNA 片段替代。右边区域（基因 gam 右边至基因 Rz）包含噬菌体复制和裂解宿主菌所必须的基因。3333溶菌控制基因溶菌控制基因晚期控制基因晚期控制基因DNADNA合成控制基因合成控制基因阻遏基因阻遏基因早期控制基因早期控制基因阻遏基因阻遏基因重组基因重组基因删除与整合基因删除与整合基因coscos-DNA头部合成基因头部合成基因尾部合成基因尾部合成基因5 TCCAGCGGCGGGG5 TCCAGCGGCGGGGCOSCCCG

23、CCGCTGGA 5CCCGCCGCTGGA 5 COS噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：生物结构生物结构（一）噬菌体的发育调节1吸附（adsorption）2立即早期转录（immediate early transcription）3延迟早期转录（delayed early transcription）4溶源和裂解的感染分化5进入裂解生长6溶源化（二）噬菌体的可取代区在溶源状态，噬菌体DNA整合在半乳糖代谢基因gal和生物素合成基因bio之间。噬菌体在某些条件下，会从宿主染色体上切离出来，进入裂解循环。切离和整合是相互对立的过程，在不同重组酶的作用下，导致切离或整合的发生。1.区域溶源化噬

24、菌体的正确切离正常噬菌体不正确切离不正常噬菌体 gal替换或bio替换J基因与Cro基因之间的DNA被ga1基因或bio基因替换后，不影响噬菌体裂解生长。2.大小占噬菌体DNA的1/3，主要包含控制噬菌体进入溶源状态的调节基因和功能基因。60%区域为裂解生长所必须的，左臂：约20kb，含有编码噬菌体头部和尾部蛋白的基因，即从基因A至基因J的区域右臂：约为8-10kb，从PR启动子到右侧cos位点可插入的外源DNA片段大小为9-23kb二、二、噬菌体的选择标记噬菌体的选择标记1基因组大小噬菌体的遗传学研究发现，重组噬菌体的基因组DNA太大或太小会影响其存活能力。当基因组DNA长度为野生型噬菌体基

25、因组DNA的78105%时，不会明显影响存活能力。野生型噬菌体基因组DNA为48kb，若用外源DNA片段完全替换可取代区，外源DNA片段的大小将在9-23kb范围内。2lacZ基因lacZ基因也可用于噬菌体载体，通过插入或替换载体中的-半乳糖苷酶基因片段，在IPTG/X-gal平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体。uhfl+E.coli 中，噬菌体可高效率地进入溶源状态。uhfl-E.coli中，基因 c（基因c的正调节物）产物累积到较高水平。hfl-可增加基因c的产物，从而使裂解生长受到抑制，高效地进入溶源状态。u外源DNA片段插入基因c中，将高频率地使hfl-E.coli进入裂解生长状

26、态。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。u在构建基因文库时，可提高排除非重组噬菌体的效率，从而降低对基因文库进行筛选的劳动强度。3基因c失活p52c基因的表达促进噬菌体进入溶源状态，基因c产物活性受到影响会促进噬菌体进入裂解循环。三、代表性噬菌体载体插入型载体（insertionvectors）：通过特定的酶切位点允许外源DNA片段插入的载体置换型载体（replacementvectors）：允许外源DNA片段替换非必须DNA片段的载体噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。(一)插入型载体：cI

27、基因插入失活：如gt10、NM1149等载体，在cI基因上有EcoRI的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。lacZ基因插入失活：如charon16A载体，在非必需区段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位点，插入失活后利用X-gal法筛选（蓝白筛选）。插入片段大小:6-11kb1.gt1043340bp插入片段大小:设计为6kb,理论为7.6kb仅在cI基因内有一个EcoRI的酶切位点用于克隆小的cDNA而设计,外源DNA量有限时选用较好,克隆效率高(二)置换型载体：对噬菌体DNA进一步改造而

28、来，去掉大多数非必需片段，保留作为载体的必需左臂：含与包装蛋白有关的基因右臂：含与裂解生长有关的基因左右臂之间用一段填充片段（centralstuffer）替换与溶源循环有关的片段插入片段大小:9-23kb 主要用来构建基因组文库1.EMBL3/4大小为43kb，其左臂、右臂和填充片段的大小分别为20kb、9kb和14kb。从提高克隆效率角度来看，克隆DNA片段的大小为9-23kb在填充片段中带有 red 和 gam 基因，当外源片段替换填充片段后，重组体将变成 red-gam-，同时载体上含有 chiC 位点，因此可用 P2 噬菌体的溶源性大肠杆菌进行 Spi 筛选重组体。在填充片段两端带有

29、对称的多克隆位点，这两个载体的差别是多克隆位点的排列位置相反 2.Charon 4A大小为45kb，其左臂、右臂和填充片段的大小分别为19.5kb、11kb和14.7kb用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac 5作为选择标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。置换型噬菌体是使用最广泛的载体。四、四、噬菌体载体的克隆原理及步骤噬菌体载体的克隆原理及步骤步骤：1.通过裂解过程增殖载体2.载体与外源DNA的酶切。应用适当的核

30、酸内切酶消化载体，除去可取代的DNA片段；3.外源DNA与载体的连接。将上述所得的DNA载体臂同外源DNA片段连接；4.重组噬菌体的体外包装。对重组体的DNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的重组噬菌体5.包装噬菌体颗粒的感染6.筛选体外包装噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达106108pfu/gDNA，而以转染的方式导入的频率仅为103105pfu/gDNA。噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5kb）的78%105%。由于噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的78%或超过1

31、05%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型DNA（48.5KB）的78%-105%左右的DNA，要求载体DNA和外源DNA长度之和在3953kb之间。插入式载体可携带的外源DNA片段较置换型为小。1.连接连接2.组装组装3.侵染侵染Charon4A根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选第六节第六节 表达载体表达载体Expressionvectors主要用来使外源基因表达出蛋白质产物主要用来使外源基因表达出蛋白质产物 注意：启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的

32、转录翻译信号控制之下。表达载体的结构表达载体的结构 复制起始点复制起始点ORI、选择标记、选择标记、多克隆位点多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因阻遏基因I操纵基因操纵基因O启动基因启动基因P核糖体结合位点序列（核糖体结合位点序列（SD）转录终止信号区。转录终止信号区。1）普通载体元件）普通载体元件 一、大肠杆菌表达载体一、大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体都是质粒载体。作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求，即能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中。在基本骨架的基础上增加表达元件，就构成了表达载体。各种表达载体的不同之处在于其表达元件的差异。1表达融合蛋白的表达载体

33、基因融合就是将两个或多个开放阅读框架按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂合蛋白，即融合蛋白（fusionprotein）。融合蛋白有两种不同的含义n一种是通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物.指在基因水平将目的蛋白基因同某个高表达蛋白片段基因相连，并在真核或原核细胞中表达出的具有上述两部分结构域的重组蛋白 n另一种含义就是介导两个细胞质膜融合的一组蛋白,如在仙台病毒脂双层外侧小叶中含有的两种糖蛋白之一,介导病毒被膜与宿主细胞质膜的融合作用。另一种糖蛋白是血细胞凝集素神经酰胺酶。为什么要表达融合蛋白p当蛋白质表达以后，有效的分离纯化或分泌就成为获得目标蛋白的关键因素。

34、p通过以融合蛋白的形式表达，并利用载体编码的蛋白或多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽（fusionTag），fusiontag所编码的可能是整个功能蛋白或是其中的部分p常用的有谷胱甘肽转移酶（glutathioneS-transferase,GST）、六聚组氨酸肽（polyHis-6）、蛋白质A（proteinA）和纤维素结合位点（cellulosebindingdomain）等。p目的蛋白可连接在标签蛋白或标签多肽的氨基端或羧基端一般融合载体图解（1）表达GST融合蛋白的载体 P90GST表达载体在启动子tac和多克隆位点之间加入了两个与分离

35、纯化有关的编码序列l谷胱甘肽S转移酶基因GSTl凝血蛋白酶（Thrombin）切割位点的编码序列当外源基因插入到多克隆位点后，可表达出由三部分序列组成的融合蛋白。GST是来源于血吸虫的小分子酶（26kDa），在E.coli 易表达，在融合蛋白状态下保持酶学活性，对谷胱甘肽有很强的结合能力分离纯化：将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱，当表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱时，融合蛋白将吸附在树脂内，其它细胞蛋白就被洗脱出来。再用含游离的还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱，可将融合蛋白释放出来。用凝血蛋白酶切割融合蛋白，便可获得纯化的目标蛋白。除了凝血蛋白酶的切割位点外，其它还有Xa因子（Fact

36、orXa）和肠激酶。（2）利用 T7 噬菌体启动子的表达载体p88表达载体pET-5a是典型的pET载体，其组成是在载体的基本结构的基础上加入了T7噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点。当外源基因插入到这些酶切位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。（3）组氨酸标签表达载体利用组氨酸标签的表达载体有很多，在pET系列载体中也有如pET-16b.u主体框架与pET-5a相似：多一个lac基因u主要差别：在启动子下游含有一段编码6个组氨酸His的序列和编码Xa因子酶切位点的序列表达：当外源基因插入到BamH等位点后，在BL21(DE3)菌株中可表达出带His-6标签的融合蛋白分离提纯：多聚组氨酸

37、肽能与2价重金属阳离子镍离子结合，将镍固定在树脂上，便可对带His标签的融合蛋白进行亲和层析分析纯化的融合蛋白再用Xa因子处理可除去标签多肽，从而获得纯化的目的蛋白（4）内含肽标签表达载体NEB发展的一套IMPACT-TWIN表达系统，将目的蛋白放在两个可自裂解的内含肽intein中间，在得到融合蛋白之后不通过蛋白酶水解就可将标签蛋白切除如载体pTWIN1，其基本结构与pET-16b相似，只是表达元件不同利用T7噬菌体启动子，其后依次为几丁质结合结构域（chitinbindingdomain,CBD）、intein1、多克隆位点、intein2和CBD。Intein1蓝细菌dnaB基因产物的微

38、型intein，在特定pH和温度下，在该inteinC端发生水解，从而将intein与其下游的多肽序列分开Intein2蟾蜍分枝杆菌gyrA基因产物或热自养烷杆菌rir1基因产物的微型intein，可在其N端进行巯基诱导的水解，利于目的蛋白形成二硫键表达和分离提纯u在pTWIN1中，当外源目的基因插入多克隆位点并带有自身的翻译终止密码子时，可表达出在目的蛋白末端带有CBD和intein1的融合蛋白。u表达该融合蛋白的细胞抽提物流过几丁质树脂层析柱时，融合蛋白就被吸附在树脂上u通过洗涤可将其它蛋白除去u调节层析柱的pH至7.0并于室温放置，目的蛋白与intein之间发生水解u通过洗脱便得到纯化的

39、目的蛋白（5）分泌型表达载体除了在细胞内表达外，还可让表达的蛋白分泌到细胞外或细胞周质区中。可避免细胞内蛋白酶的降解，或使表达的蛋白正确折叠，或去除N-末端的甲硫氨酸，从而达到维护目标蛋白活性的目的。利用信号肽序列作为融合标签可将融合蛋白分泌到细胞外，可利用的信号肽有碱性磷酸酶的信号肽和蛋白质A的信号肽。表达载体pEZZ18的表达元件：lac启动子、蛋白质A的信号肽序列和两个合成的Z功能域（domain）蛋白质A：来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus），具有与抗体IgG结合的能力，Z功能域就是根据蛋白质A中结合IgG的B功能域而设计的。融合蛋白表达后，在信号肽序列的指导

40、下，分泌到培养基中。然后用固定了IgG的琼脂糖层析柱，通过与ZZ功能域的结合而得到纯化的融合蛋白。这个14kDa的“ZZ”肽链对融合蛋白的正确折叠几乎没有影响。2非融合蛋白表达载体pKK223-3表达载体：4584bp使用的启动子：tac强启动子，杂合启动子trp-lac终止子：5SrRNA区域（rrnB操纵子区域），rrnBT和rrnBT2终止子（防止通读）受lac阻抑物调控，1-5mMIPTG诱导可直接表达任何含RBS和ATG的基因，若无RBS，其ATG需与固有RBS相隔5-13bp。二、穿梭载体二、穿梭载体Shuttlevector定义:能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。如有些

41、载体既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制，或能在E.coli 中复制又能在革兰氏阳性细菌中复制。这类载体主要是质粒载体。由于复制和选择都是有宿主专一性的,穿梭载体至少应含有两套复制单元和两套选择标记,相当于两个载体的联合.添加其它宿主的ori和选择标记,突出在非大肠杆菌中的操作1.大肠杆菌/革兰氏阳性细菌穿梭载体是典型的穿梭载体，其作用主要是将目标基因转移到芽胞杆菌或球菌中去。枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌的代表种,但研究早期几乎没有发现其有质粒.因此应用于该细菌的穿梭载体的质粒复制区主要来自球菌或其它芽孢杆菌.2大肠杆菌/酵母菌穿梭载体酵母菌除了在真核生物的细胞生物学研究方面发挥重要作用外

42、，在作为蛋白质的真核表达系统方面也显示出巨大威力。大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体，含有分别来自大肠杆菌和酿酒酵母的复制起点与选择标记，另有一个多克隆位点区。由于此类型的载体既可在大肠杆菌细胞中复制，也可在酿酒酵母细胞中复制，因此在遗传学研究中很受欢迎。它使研究工作者可自如的在两种不同的寄主细胞之间来回转移基因，并单独或同时在两种宿主细胞中研究目的基因的表达活性及其它的调节功能。3其它穿梭载体在哺乳动物、植物、昆虫细胞等细胞中使用的表达载体或其它载体，一般都有在大肠杆菌中复制的元件，因此都具备穿梭载体的特征 三、整合载体三、整合载体在生物学研究和基因工程应用中，会涉及将某个基因或某些基因插入到染

43、色体中去的工作，承担这部分工作的载体，可称为整合载体（integrationvector）。根据整合方式的不同：定点整合和随机整合按其作用：目标基因的插入或敲除随机突变体库的构建1基因插入knock-in/基因敲除knock-out当外源基因整合到宿主细胞的染色体后，可以稳定的遗传，进而达到稳定表达的目的.在实验研究中，经常需要敲除某个基因，从而验证其功能.同源重组整合载体是最常用的整合载体，该载体一方面含有大肠杆菌克隆载体的骨架，更主要的是含有一段便于同源重组的重组DNA片段。从染色体上待插入位点处取出一段DNA，将选择标记基因和多克隆位点插入到这个片段中间得到这一重组DNA片段。基因敲除和

44、基因嵌入技术基因敲除和基因嵌入技术该技术是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技术。基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。基因嵌入又称基因置换，它是利用内源基因序列两侧或外面的断裂点，用同源序列的目的基因整个置换内源基因。2随机插入突变载体 随着功能基因组研究的发展，不断需要一系列发生基因突变的材料。为了满足这一要求，构建随机突变体库便进入到研究工作中。随机突变体库：指标记基因在载体的携

45、带下通过DNA重组事件随机插入基因组中而形成的突变体的集合。为了提高标记基因插入到基因组中的频率，一般都要借助转座子来帮忙。本章小结将外源DNA或基因携带入宿主细胞（hostcell）的工具称为载体，载体是基因操作的核心工具。质粒载体是最常见的载体，也是使用最方便的载体。它应用了质粒的复制、拷贝数及不相容性等性质。质粒载体有抗性基因、琥珀突变抑制基因等多种选择标记和-互补、插入失活等筛选标记。常见的质粒载体有：pBR322、pUC18/19、pUC118/119、pGEM-3Z/4Z以及一些多功能的质粒载体，如：pBluescriptKS（）。噬菌体载体应用了噬菌体的生物学性质。噬菌体有溶源状

46、态和裂解循环两种状态，有着复杂的分子生物学调控机制。噬菌体载体有大小、lacZ基因、cI基因失活以及Spi筛选等选择标记，分为插入型载体和置换型载体。常见的插入型载体有：gt10、gt11及其衍生载体和Excell载体等。常见的置换型载体有：EMBL3/4及其类似载体，gem-11载体。噬菌体载体M13噬菌体是一种单链噬菌体，基于其构建的载体可以制备单链DNA。常见的M13噬菌体载体有M13mp18/19，其受体细胞有特殊的遗传标志。带有丝状噬菌体大间隔区的质粒叫噬菌粒，噬菌粒工作的时候需要M13K07辅助噬菌体的帮助。M13 噬菌体载体大肠杆菌表达载体是最常见的表达载体，可分为表达融合蛋白的载体和非融合蛋白表达载体。常用的标签蛋白有谷胱甘肽转移酶、六聚组氨酸肽、蛋白质A和纤维素结合位点等。穿梭载体和整合载体在基因操作中也扮演着重要的角色。表达载体