基因克隆载体 (2)课件.ppt

《基因克隆载体 (2)课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因克隆载体 (2)课件.ppt（108页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、关于基因克隆载体关于基因克隆载体(2)课课件件现在学习的是第1页，共108页定义定义通过不同途径将承载的外源通过不同途径将承载的外源通过不同途径将承载的外源通过不同途径将承载的外源DNADNADNADNA片段（基因）带入受体细胞且能在其中维片段（基因）带入受体细胞且能在其中维片段（基因）带入受体细胞且能在其中维片段（基因）带入受体细胞且能在其中维持的持的持的持的DNADNADNADNA分子。也称分子。也称分子。也称分子。也称DNADNADNADNA克隆载体。克隆载体。克隆载体。克隆载体。必备条件必备条件1 1 1 1、克隆位点、克隆位点、克隆位点、克隆位点(一个或多个一个或多个一个或多个一个或

2、多个)2 2 2 2、能携带外源、能携带外源、能携带外源、能携带外源DNADNADNADNA片段进入受体细胞片段进入受体细胞片段进入受体细胞片段进入受体细胞:能自我复制，或整入染色体随受体细胞能自我复制，或整入染色体随受体细胞能自我复制，或整入染色体随受体细胞能自我复制，或整入染色体随受体细胞DNADNADNADNA复制而复制。复制而复制。复制而复制。复制而复制。3 3 3 3、有选择克隆子的标记基因、有选择克隆子的标记基因、有选择克隆子的标记基因、有选择克隆子的标记基因4 4 4 4、安全性、安全性、安全性、安全性(不含损害受体的基因不含损害受体的基因不含损害受体的基因不含损害受体的基因,不

3、任意转入别的不任意转入别的不任意转入别的不任意转入别的,尤其人的细胞尤其人的细胞尤其人的细胞尤其人的细胞)意义：意义：基因工程随载体系统的建立而兴起，构建新载体一直是基础研基因工程随载体系统的建立而兴起，构建新载体一直是基础研基因工程随载体系统的建立而兴起，构建新载体一直是基础研基因工程随载体系统的建立而兴起，构建新载体一直是基础研究的优先领域。究的优先领域。究的优先领域。究的优先领域。现在学习的是第2页，共108页按克隆载体的来源分：按克隆载体的来源分：按克隆载体的来源分：按克隆载体的来源分：质粒质粒质粒质粒病毒或噬菌体病毒或噬菌体病毒或噬菌体病毒或噬菌体质粒与病毒或噬菌体质粒与病毒或噬菌体

4、质粒与病毒或噬菌体质粒与病毒或噬菌体DNADNADNADNA组成的组成的组成的组成的质粒与染色体质粒与染色体质粒与染色体质粒与染色体DNADNADNADNA片段组成的片段组成的片段组成的片段组成的按应用范围分：按应用范围分：表达型表达型 启动子探针型启动子探针型 cDNA cDNA 按应用对象分：按应用对象分：原核生物原核生物 植物植物 动物动物 分分 类类现在学习的是第3页，共108页.质粒克隆载体质粒克隆载体定义：定义：定义：定义：以质粒以质粒以质粒以质粒DNADNADNADNA为基础构建而成的载体，适于原核和植物的基因转移、为基础构建而成的载体，适于原核和植物的基因转移、为基础构建而成的

5、载体，适于原核和植物的基因转移、为基础构建而成的载体，适于原核和植物的基因转移、建立基因组文库和建立基因组文库和建立基因组文库和建立基因组文库和c DNAc DNAc DNAc DNA基因文库。基因文库。基因文库。基因文库。一、质粒适于载体构建的一、质粒适于载体构建的一、质粒适于载体构建的一、质粒适于载体构建的性质性质性质性质、组成与构型、组成与构型、组成与构型、组成与构型是染色体外裸露的双链是染色体外裸露的双链是染色体外裸露的双链是染色体外裸露的双链DNADNADNADNA分子分子分子分子（细菌、真菌、蓝藻、绿藻）（细菌、真菌、蓝藻、绿藻）（细菌、真菌、蓝藻、绿藻）（细菌、真菌、蓝藻、绿藻）

6、现在学习的是第4页，共108页构型：构型：构型：构型：l-DNAl-DNAl-DNAl-DNAoc-DNAoc-DNAoc-DNAoc-DNAccc-DNAccc-DNAccc-DNAccc-DNA现在学习的是第5页，共108页、分子大小：、分子大小：100102 kb、复制、复制特点：在宿主细胞内；特点：在宿主细胞内；单向；单向；质粒和宿主细胞双重遗传系统控制质粒和宿主细胞双重遗传系统控制现在学习的是第6页，共108页复制强度：拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值）复制强度：拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值）复制强度：拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值）复制强度：拷贝数（细胞内质粒与染

7、色体数量之比值）（）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定（）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定（）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定（）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定严紧控制型：严紧控制型：严紧控制型：严紧控制型：11数个拷贝；大质粒数个拷贝；大质粒数个拷贝；大质粒数个拷贝；大质粒松驰控制型：松驰控制型：松驰控制型：松驰控制型：1010个以上拷贝；小质粒。个以上拷贝；小质粒。个以上拷贝；小质粒。个以上拷贝；小质粒。经氯霉素处理，经氯霉素处理，经氯霉素处理，经氯霉素处理，宿主中质粒大量扩增（如宿主中质粒大量扩增（如宿主中质粒大量扩增（如宿主中质粒大量扩增（如ColE1ColE1

8、拷贝数达拷贝数达拷贝数达拷贝数达30003000个）。个）。个）。个）。现在学习的是第7页，共108页（）质粒复制的控制因素（）质粒复制的控制因素（）质粒复制的控制因素（）质粒复制的控制因素 copcopcopcop基因基因基因基因：指令宿主合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数时，阻遏物也：指令宿主合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数时，阻遏物也：指令宿主合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数时，阻遏物也：指令宿主合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数时，阻遏物也合成积累，直到阻止质粒的继续复制。合成积累，直到阻止质粒的继续复制。合成积累，直到阻止质粒的继续复制。合成积累，直到阻止质粒的继续复制。现在学习

9、的是第8页，共108页reprepreprep基因基因基因基因：指令宿主合成一种调节蛋白，促进质粒的复制：指令宿主合成一种调节蛋白，促进质粒的复制：指令宿主合成一种调节蛋白，促进质粒的复制：指令宿主合成一种调节蛋白，促进质粒的复制parparparpar序列序列序列序列：附着在细胞膜上，使质粒随细胞分裂而正确地分配到子细：附着在细胞膜上，使质粒随细胞分裂而正确地分配到子细：附着在细胞膜上，使质粒随细胞分裂而正确地分配到子细：附着在细胞膜上，使质粒随细胞分裂而正确地分配到子细胞中，维持相对稳定的拷贝数胞中，维持相对稳定的拷贝数胞中，维持相对稳定的拷贝数胞中，维持相对稳定的拷贝数现在学习的是第9页

10、，共108页、质粒的不亲合性、质粒的不亲合性、质粒的不亲合性、质粒的不亲合性n n亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒n n意义：宿主细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，意义：宿主细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，意义：宿主细胞内的原有质

11、粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，意义：宿主细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，最好不含内源性质粒最好不含内源性质粒最好不含内源性质粒最好不含内源性质粒、质粒迁移、质粒迁移、质粒迁移、质粒迁移（）接合质粒：（）接合质粒：（）接合质粒：（）接合质粒：含含含含tratratratra基因基因基因基因合成细胞表面物质（鞭毛）合成细胞表面物质（鞭毛）合成细胞表面物质（鞭毛）合成细胞表面物质（鞭毛）质粒质粒质粒质粒DNADNADNADNA入受体细胞入受体细胞入受体细胞入受体细胞含含含含tratratratra基因的质粒称为基因的质粒称为基因的质粒称为基因的质粒称为接合质粒接合质粒接合质粒

12、接合质粒。如。如。如。如F F F F、TiTiTiTi等等等等不含不含不含不含tratratratra基因的质粒称为基因的质粒称为基因的质粒称为基因的质粒称为非接合质粒非接合质粒非接合质粒非接合质粒。如。如。如。如ColE1ColE1ColE1ColE1、pPbSpPbSpPbSpPbS等等等等现在学习的是第10页，共108页（）迁移作用（）迁移作用（）迁移作用（）迁移作用不含不含不含不含tratratratra基因而含基因而含基因而含基因而含bombombombom（oriorioriori）位点的质粒，当宿主细胞存在）位点的质粒，当宿主细胞存在）位点的质粒，当宿主细胞存在）位点的质粒，当

13、宿主细胞存在辅辅助质粒助质粒mobmob基因基因产物时，即可打开产物时，即可打开产物时，即可打开产物时，即可打开oriorioriori位点，非结合质粒借位点，非结合质粒借位点，非结合质粒借位点，非结合质粒借助助助助接合质粒接合质粒tratra基因基因的产物而迁移入受体细胞。这种现象称的产物而迁移入受体细胞。这种现象称的产物而迁移入受体细胞。这种现象称的产物而迁移入受体细胞。这种现象称质质粒粒的的迁迁移移作作用用现在学习的是第11页，共108页、显性质粒和隐蔽质粒、显性质粒和隐蔽质粒、显性质粒和隐蔽质粒、显性质粒和隐蔽质粒n n宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，称为显性（表宿主因含某种质粒而呈

14、现出新的性状，称为显性（表宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，称为显性（表宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，称为显性（表达型）质粒。达型）质粒。达型）质粒。达型）质粒。n n显性质粒显性质粒显性质粒显性质粒质粒：质粒：含有氨苄青霉素含有氨苄青霉素含有氨苄青霉素含有氨苄青霉素ApApApAp、氯霉素、氯霉素、氯霉素、氯霉素CmCmCmCm、卡、卡、卡、卡那霉素那霉素那霉素那霉素KmKmKmKm、四环素、四环素、四环素、四环素TcTcTcTc、链霉素、链霉素、链霉素、链霉素SmSmSmSm等药物的抗性基因，等药物的抗性基因，等药物的抗性基因，等药物的抗性基因，可作为选择标记。可作为选择标记。可作为选

15、择标记。可作为选择标记。ColCol质粒质粒质粒质粒降解质粒降解质粒i i质粒质粒n n隐蔽质粒隐蔽质粒隐蔽质粒隐蔽质粒蓝藻内源质粒蓝藻内源质粒蓝藻内源质粒蓝藻内源质粒现在学习的是第12页，共108页二、二、二、二、质粒克隆载体构建的基本策略质粒克隆载体构建的基本策略质粒克隆载体构建的基本策略质粒克隆载体构建的基本策略、能进行有效复制、能进行有效复制、能进行有效复制、能进行有效复制复制起始位点（最好是多拷贝）复制起始位点（最好是多拷贝）复制起始位点（最好是多拷贝）复制起始位点（最好是多拷贝）、克隆位点、克隆位点、克隆位点、克隆位点组装组装组装组装MCSMCSMCSMCS连杆连杆连杆连杆、选择标

16、记基因、选择标记基因、选择标记基因、选择标记基因抗性基因，抗性基因，抗性基因，抗性基因，Lac ZLac ZLac ZLac Z基因基因基因基因、分子尽可能小（转化率高），、分子尽可能小（转化率高），、分子尽可能小（转化率高），、分子尽可能小（转化率高），15kb15kb15kb15kb，转化率，转化率，转化率，转化率、组装各种、组装各种、组装各种、组装各种“元件元件元件元件”，如启动子、终止子等，如启动子、终止子等，如启动子、终止子等，如启动子、终止子等现在学习的是第13页，共108页三、质粒克隆载体构建三、质粒克隆载体构建n n过程过程过程过程：严密的实验设计：严密的实验设计：严密的实验设

17、计：严密的实验设计构建（切割、修饰和连接重组）构建（切割、修饰和连接重组）构建（切割、修饰和连接重组）构建（切割、修饰和连接重组）n n构建原则构建原则构建原则构建原则1 1 1 1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如oriorioriori、选择标记、克隆位点、启动子和终、选择标记、克隆位点、启动子和终、选择标记、克隆位点、启动子和终、选择标记、克隆位点、启动子和终止子止子止子止子2 2 2 2、正确获得构建质粒克隆载体的元件、正确获得构建质粒克隆载体的元件、正确获得构建质粒克

18、隆载体的元件、正确获得构建质粒克隆载体的元件3 3 3 3、组装合适的选择标记基因、组装合适的选择标记基因、组装合适的选择标记基因、组装合适的选择标记基因4 4 4 4、选用合适的启动子、选用合适的启动子、选用合适的启动子、选用合适的启动子5 5 5 5、构建过程力求简单、构建过程力求简单、构建过程力求简单、构建过程力求简单n n代表性实例。代表性实例。代表性实例。代表性实例。现在学习的是第14页，共108页（一）（一）（一）（一）pBR322pBR322pBR322pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建及其衍生质粒克隆载体的构建及其衍生质粒克隆载体的构建及其衍生质粒克隆载体的构建、pBR32

19、2pBR322构建构建n n质粒载体命名法则质粒载体命名法则质粒载体命名法则质粒载体命名法则“pBR322”pBR322”pBR322”pBR322”p p p p：质粒（：质粒（：质粒（：质粒（plasmid)plasmid)plasmid)plasmid)BRBRBRBR：两位主要构建者：两位主要构建者：两位主要构建者：两位主要构建者322322322322：实验编号：实验编号：实验编号：实验编号pSC101pSC101pSC101pSC101（最早用于（最早用于（最早用于（最早用于DNADNADNADNA克隆的载体），严紧型克隆的载体），严紧型克隆的载体），严紧型克隆的载体），严紧型Co

20、lE1ColE1ColE1ColE1 松驰型松驰型松驰型松驰型 ，筛选系统复杂，筛选系统复杂，筛选系统复杂，筛选系统复杂现在学习的是第15页，共108页现在学习的是第16页，共108页n n构建过程构建过程构建过程构建过程(出发质粒：出发质粒：出发质粒：出发质粒：pMB1pMB1)现在学习的是第17页，共108页R1R1R1R1（沙门氏菌中分离）（沙门氏菌中分离）（沙门氏菌中分离）（沙门氏菌中分离）变异变异变异变异 R1drd19 R1drd19 R1drd19 R1drd19（含易位子（含易位子（含易位子（含易位子Tn3 ApTn3 ApTn3 ApTn3 Apr r r r）R1drd19

21、 Tn3 R1drd19 Tn3 R1drd19 Tn3 R1drd19 Tn3 pSF2124pSF2124 ColE1 ColE1 ColE1 ColE1 n npBR322pBR322pBR322pBR322的三个亲本：的三个亲本：的三个亲本：的三个亲本：pMB1pMB1、pSF2124pSF2124、pSC101pSC101n n识别位点：识别位点：识别位点：识别位点：ApApApApr r r r基因区（基因区（基因区（基因区（3 3 3 3个个个个 ）：）：）：）：PstPstPstPst、Sca Sca Sca Sca 、Pvu Pvu Pvu Pvu TcTcTcTcr r r

22、 r基因区（基因区（基因区（基因区（7 7 7 7个个个个 ）：）：）：）：BamH BamH BamH BamH 、Scal Scal Scal Scal 、EcoREcoREcoREcoR、Sph Sph Sph Sph 、Nhe Nhe Nhe Nhe 、Nru Nru Nru Nru 、XmaXmaXmaXmaTcTcTcTcr r r r启动子区（启动子区（启动子区（启动子区（2 2 2 2个个个个 ）：）：）：）：Cla Cla Cla Cla 、HindHindHindHindn npBR322pBR322pBR322pBR322分子大小：分子大小：分子大小：分子大小：4363b

23、p4363bp4363bp4363bp现在学习的是第18页，共108页现在学习的是第19页，共108页现在学习的是第20页，共108页3 3、优点、优点（1 1）较小的分子量）较小的分子量10kb10kb以内以内DNADNA分子纯化过程中可避免断裂，分子纯化过程中可避免断裂，pBR322pBR322易于自身纯化，且可克隆易于自身纯化，且可克隆6kb6kb左右的外源左右的外源DNADNA（2 2）较高的拷贝数）较高的拷贝数经氯霉素扩培后达经氯霉素扩培后达100010003000 copys/cell 3000 copys/cell （3 3）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择）具有两种抗菌

24、素抗性基因可供作转化子的选择标记。插入失活（图解）标记。插入失活（图解）现在学习的是第21页，共108页现在学习的是第22页，共108页、pUC18/19pUC18/19质粒载体质粒载体n n与与与与pBR322pBR322pBR322pBR322区别：乳糖操纵子的一个区别：乳糖操纵子的一个区别：乳糖操纵子的一个区别：乳糖操纵子的一个DNADNADNADNA片段（片段（片段（片段（lac Zlac Zlac Zlac Z基因）基因）基因）基因）替换替换替换替换TcTcTcTcr r r r基因；组装了一个多克隆位点（基因；组装了一个多克隆位点（基因；组装了一个多克隆位点（基因；组装了一个多克隆

25、位点（MCSMCSMCSMCS）连杆）连杆）连杆）连杆n n命名命名命名命名p UCUniversity of Californiap UCUniversity of Californiap UCUniversity of Californiap UCUniversity of California的科学家首先构建。图的科学家首先构建。图的科学家首先构建。图的科学家首先构建。图3-33-33-33-3。pUCpUCpUCpUC包括四个组成部分：包括四个组成部分：包括四个组成部分：包括四个组成部分：（1 1 1 1）pBR322pBR322pBR322pBR322的复制起点的复制起点的复制起点的

26、复制起点(ori)(ori)(ori)(ori)（2 2 2 2）ApApApApr r r r基因，但基因，但基因，但基因，但DNADNADNADNA序列发生变化，不再含原来限制性核酸内切识别位点序列发生变化，不再含原来限制性核酸内切识别位点序列发生变化，不再含原来限制性核酸内切识别位点序列发生变化，不再含原来限制性核酸内切识别位点 （3 3 3 3）lacZlacZlacZlacZ基因基因基因基因 （4 4 4 4）在）在）在）在lacZlacZlacZlacZ基因基因基因基因 内部靠近内部靠近内部靠近内部靠近5555端有一段端有一段端有一段端有一段MCSMCSMCSMCS连杆连杆连杆连杆

27、现在学习的是第23页，共108页现在学习的是第24页，共108页4 4 4 4、pBR322pBR322pBR322pBR322衍生的质粒衍生的质粒衍生的质粒衍生的质粒 缺失缺失缺失缺失bombombombom位点位点位点位点 pBR325pBR325pBR325pBR325、pBR327pBR327pBR327pBR327，不具被动迁移作用，不具被动迁移作用，不具被动迁移作用，不具被动迁移作用 再移去再移去再移去再移去HaeHaeHaeHae片段片段片段片段pAT153pAT153pAT153pAT153 均更安全均更安全均更安全均更安全现在学习的是第25页，共108页n nLac ZLac

28、 ZLac ZLac Z筛选机制：筛选机制：筛选机制：筛选机制：含乳糖操纵子的启动子、调节因子和含乳糖操纵子的启动子、调节因子和含乳糖操纵子的启动子、调节因子和含乳糖操纵子的启动子、调节因子和-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的N N N N端端端端146146146146残基残基残基残基(-(-(-(-肽肽肽肽)合成有活性的合成有活性的合成有活性的合成有活性的 基因基因基因基因（lac Zlac Zlac Zlac Z）的质粒载体引入可编）的质粒载体引入可编）的质粒载体引入可编）的质粒载体引入可编 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶 码码码码C C C C端部分残基的宿

29、主端部分残基的宿主端部分残基的宿主端部分残基的宿主(与与与与Lac ZLac ZLac ZLac Z互补互补互补互补 的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌)在含在含在含在含IPTGIPTGIPTGIPTG（异丙基（异丙基（异丙基（异丙基-D-D-D-D-硫代半乳糖苷）和硫代半乳糖苷）和硫代半乳糖苷）和硫代半乳糖苷）和 X-galX-galX-galX-gal（5-5-5-5-溴溴溴溴-4-4-4-4-氯氯氯氯-3-3-3-3-吲哚吲哚吲哚吲哚-D-D-D-D-半乳糖）半乳糖）半乳糖）半乳糖）蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落的诱导培养基上培养的诱导培养基上培养的诱导培养基上培养的诱导培养基上

30、培养 在在在在N N N N端端端端-肽的编码区插入肽的编码区插入肽的编码区插入肽的编码区插入MCS MCS MCS MCS 不影响不影响不影响不影响lac Zlac Zlac Zlac Z基因功能基因功能基因功能基因功能 插入外源插入外源插入外源插入外源DNA DNA DNA DNA 灭活灭活灭活灭活lac Zlac Zlac Zlac Z基因基因基因基因 白色菌落白色菌落白色菌落白色菌落现在学习的是第26页，共108页现在学习的是第27页，共108页n npUCpUC质粒载体的优点质粒载体的优点（1 1 1 1）分子量更小、拷贝数更高）分子量更小、拷贝数更高）分子量更小、拷贝数更高）分子量

31、更小、拷贝数更高（2 2 2 2）免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时）免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时）免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时）免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时（3 3 3 3）MCSMCSMCSMCS区方便转移外源区方便转移外源区方便转移外源区方便转移外源DNADNADNADNA在不同载体系列中在不同载体系列中在不同载体系列中在不同载体系列中 “穿梭穿梭穿梭穿梭”，使具有两种不同粘末端的外源，使具有两种不同粘末端的外源，使具有两种不同粘末端的外源，使具有两种不同粘末端的外源DNADNADNADNA 能直接克隆入能直接克隆入能直接克隆入能直接克隆入p UCp U

32、Cp UCp UC载体载体载体载体现在学习的是第28页，共108页（二）蓝藻质粒克隆载体（二）蓝藻质粒克隆载体pPKE2pPKE2的构建的构建大肠杆菌质粒不能转化蓝藻大肠杆菌质粒不能转化蓝藻蓝藻内的质粒属隐蔽质粒蓝藻内的质粒属隐蔽质粒即：即：即：即：大肠杆菌源质粒复制起始点大肠杆菌源质粒复制起始点大肠杆菌源质粒复制起始点大肠杆菌源质粒复制起始点 +蓝藻源质粒复制起始点。蓝藻源质粒复制起始点。蓝藻源质粒复制起始点。蓝藻源质粒复制起始点。pPbs（1511bp）pPbs Cla 重组重组 pPRS-1 多次亚克隆多次亚克隆 pPKE-2pBR322 组装组装组装组装CaMV35sCaMV35sCa

33、MV35sCaMV35s启动子、启动子、启动子、启动子、MCSMCSMCSMCS、rbcSrbcSrbcSrbcS终止子、终止子、终止子、终止子、KmKmKmKmr r r r基因基因基因基因（图（图3-5）构建穿梭质粒构建穿梭质粒现在学习的是第29页，共108页现在学习的是第30页，共108页（三）农杆菌（三）农杆菌（三）农杆菌（三）农杆菌TiTiTiTi质粒克隆载体的构建质粒克隆载体的构建质粒克隆载体的构建质粒克隆载体的构建 TiTiTiTi质粒质粒质粒质粒：根癌农杆菌中引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤）的质粒，故称：根癌农杆菌中引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤）的质粒，故称：根癌农杆菌中引发植物产生肿瘤

34、（冠瘿瘤）的质粒，故称：根癌农杆菌中引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤）的质粒，故称Tumor Tumor Tumor Tumor inducing plasmidinducing plasmidinducing plasmidinducing plasmid（TiTiTiTi质粒）。双链环状质粒）。双链环状质粒）。双链环状质粒）。双链环状DNADNADNADNA分子，分子，分子，分子，200200200200250kb250kb250kb250kb。1 1 1 1、4 4 4 4个功能区：个功能区：个功能区：个功能区：T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA区、区、区、区、VirVirVirVir区、

35、区、区、区、ConConConCon区、区、区、区、OriOriOriOri区区区区（1 1 1 1）T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA区区区区TiTiTiTi质粒进入植物细胞的约质粒进入植物细胞的约质粒进入植物细胞的约质粒进入植物细胞的约25kb25kb25kb25kb部分，即部分，即部分，即部分，即T-DNA T-DNA T-DNA T-DNA（transfer DNA)transfer DNA)transfer DNA)transfer DNA)。左右边界各有一个左右边界各有一个左右边界各有一个左右边界各有一个25bp25bp25bp25bp正向重复序列（正向重复序列（正向重复序列

36、（正向重复序列（LTSLTSLTSLTS和和和和RTSRTSRTSRTS）称为）称为）称为）称为边界序列边界序列边界序列边界序列，为为为为T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA的转移和整合所必需。只要保留的转移和整合所必需。只要保留的转移和整合所必需。只要保留的转移和整合所必需。只要保留T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA的边界序列，中间序列被的边界序列，中间序列被的边界序列，中间序列被的边界序列，中间序列被外源外源外源外源DNADNADNADNA片段替换，仍可转移整合到植物基因组中。片段替换，仍可转移整合到植物基因组中。片段替换，仍可转移整合到植物基因组中。片段替换，仍可转移整合到植物

37、基因组中。这是这是这是这是TiTiTiTi质粒用于遗传转化的理论依据。质粒用于遗传转化的理论依据。质粒用于遗传转化的理论依据。质粒用于遗传转化的理论依据。用野生型用野生型用野生型用野生型TiTiTiTi质粒获得的转基因植物细胞只能分裂，不能分化为植株，质粒获得的转基因植物细胞只能分裂，不能分化为植株，质粒获得的转基因植物细胞只能分裂，不能分化为植株，质粒获得的转基因植物细胞只能分裂，不能分化为植株，故不能直接选育转基因植物。故不能直接选育转基因植物。故不能直接选育转基因植物。故不能直接选育转基因植物。现在学习的是第31页，共108页（2 2 2 2）VirVirVirVir区区区区位于位于位于

38、位于T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA区上游，其表达产物可激活区上游，其表达产物可激活区上游，其表达产物可激活区上游，其表达产物可激活T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA的转移，显示的转移，显示的转移，显示的转移，显示致瘤性。致瘤性。致瘤性。致瘤性。（3 3 3 3）ConConConCon区区区区含有农杆菌之间接合转移有关的基因（含有农杆菌之间接合转移有关的基因（含有农杆菌之间接合转移有关的基因（含有农杆菌之间接合转移有关的基因（tra)tra)tra)tra)，可受宿主产生的，可受宿主产生的，可受宿主产生的，可受宿主产生的冠瘿碱活化，使冠瘿碱活化，使冠瘿碱活化，使冠瘿碱活化，使T

39、iTiTiTi质粒在细菌间转移，也即接合转移基因质粒在细菌间转移，也即接合转移基因质粒在细菌间转移，也即接合转移基因质粒在细菌间转移，也即接合转移基因编码区。编码区。编码区。编码区。（4 4 4 4）OriOriOriOri区区区区复制起始区，调控复制起始区，调控复制起始区，调控复制起始区，调控TiTiTiTi质粒自我复制。质粒自我复制。质粒自我复制。质粒自我复制。TiTiTiTi质粒克隆载体真正用于植物而非农杆菌，农杆菌只起中介质粒克隆载体真正用于植物而非农杆菌，农杆菌只起中介质粒克隆载体真正用于植物而非农杆菌，农杆菌只起中介质粒克隆载体真正用于植物而非农杆菌，农杆菌只起中介作用。作用。作用

40、。作用。现在学习的是第32页，共108页2 2、构建途径、构建途径（1 1 1 1）取代型载体。）取代型载体。）取代型载体。）取代型载体。用大肠杆菌质粒克隆载体取代用大肠杆菌质粒克隆载体取代用大肠杆菌质粒克隆载体取代用大肠杆菌质粒克隆载体取代TiTiTiTi质粒的全部或部分质粒的全部或部分质粒的全部或部分质粒的全部或部分T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA序序序序列列列列而构建。外源基因以同源交而构建。外源基因以同源交而构建。外源基因以同源交而构建。外源基因以同源交换而重组。换而重组。换而重组。换而重组。OncOncOncOnc-TiTiTiTi：T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA上

41、的上的上的上的onconconconc基因被取代而构建。基因被取代而构建。基因被取代而构建。基因被取代而构建。OncOncOncOnc+TiTiTiTi：pBR322pBR322pBR322pBR322取代取代取代取代 T-T-T-T-DNADNADNADNA的部分序列但保留的部分序列但保留的部分序列但保留的部分序列但保留onconconconc基基基基因而构建。进入植物细胞诱发冠因而构建。进入植物细胞诱发冠因而构建。进入植物细胞诱发冠因而构建。进入植物细胞诱发冠瘿瘤。瘿瘤。瘿瘤。瘿瘤。现在学习的是第33页，共108页（2 2 2 2）中间质粒克隆载体）中间质粒克隆载体）中间质粒克隆载体）中间

42、质粒克隆载体T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。共整合克隆载体系统（共整合克隆载体系统（共整合克隆载体系统（共整合克隆载体系统（T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA同源序列、同源序列、同源序列、同源序列、bom bom bom bom 位点）位点）位点）位点）双元克隆载体系统双元克隆载体系统双元克隆载体系统双元克隆载体系统微型微型微型微型TiTiTiTi质粒质粒质粒质粒现在学习的是第34页，共108页（四）乳酸杆菌质粒克隆载体四）乳酸杆

43、菌质粒克隆载体乳酸杆菌：乳酸杆菌：乳酸杆菌：乳酸杆菌：G+G+G+G+，非致病，益菌生，用于食品和饮料。，非致病，益菌生，用于食品和饮料。，非致病，益菌生，用于食品和饮料。，非致病，益菌生，用于食品和饮料。质粒宿主范围广泛：可用于其它质粒宿主范围广泛：可用于其它质粒宿主范围广泛：可用于其它质粒宿主范围广泛：可用于其它G+G+G+G+菌及大肠杆菌。菌及大肠杆菌。菌及大肠杆菌。菌及大肠杆菌。构建：构建：构建：构建：乳酸杆菌本身对乳酸杆菌本身对乳酸杆菌本身对乳酸杆菌本身对kmkmkmkm、ApApApAp抗性较强。抗性较强。抗性较强。抗性较强。标记基因：标记基因：标记基因：标记基因：选用选用选用选用

44、lacZlacZlacZlacZ，如有，如有，如有，如有pLJ1pLJ1pLJ1pLJ1复制启始位点的复制启始位点的复制启始位点的复制启始位点的pBG10pBG10pBG10pBG10 选用选用选用选用eryeryeryery，如有，如有，如有，如有p353-2p353-2p353-2p353-2复制启始位点的复制启始位点的复制启始位点的复制启始位点的pP3537pP3537pP3537pP3537现在学习的是第35页，共108页（五）酵母（五）酵母（五）酵母（五）酵母2m2m2m2m质粒克隆载体质粒克隆载体质粒克隆载体质粒克隆载体几乎所有酿洒酵母中都存在几乎所有酿洒酵母中都存在几乎所有酿洒酵

45、母中都存在几乎所有酿洒酵母中都存在（1 1 1 1）2m2m2m2m质粒结构质粒结构质粒结构质粒结构a a a a、环状分子内有反向重复、环状分子内有反向重复、环状分子内有反向重复、环状分子内有反向重复序列序列序列序列IR1IR1IR1IR1和和和和IR2IR2IR2IR2，可发生，可发生，可发生，可发生重组，形成重组，形成重组，形成重组，形成A A A A、B B B B型质粒；型质粒；型质粒；型质粒；有有有有oriorioriori复制起始点能自主复制起始点能自主复制起始点能自主复制起始点能自主复制。复制。复制。复制。图图3-103-10A A型酵母型酵母2m2m质粒质粒b b b b、2

46、020202080808080个个个个/细胞。细胞。细胞。细胞。有丝分裂时数目稳定，有丝分裂时数目稳定，有丝分裂时数目稳定，有丝分裂时数目稳定，减数分裂时形成减数分裂时形成减数分裂时形成减数分裂时形成cir+/cir0cir+/cir0cir+/cir0cir+/cir0现在学习的是第36页，共108页（2 2 2 2）YEpYEpYEpYEp克隆载体（酵母游离型质粒）克隆载体（酵母游离型质粒）克隆载体（酵母游离型质粒）克隆载体（酵母游离型质粒）2m2m2m2m质粒的质粒的质粒的质粒的orioriorioriEcoREcoREcoREcoR酶切酶切酶切酶切 pBR322pBR322质粒质粒 酵

47、母染色体酵母染色体酵母染色体酵母染色体URA3URA3URA3URA3基因基因基因基因HindHindHindHind酶切酶切酶切酶切 YEp24 YEp24 YEp24 YEp24 （图（图（图（图3-113-113-113-11）现在学习的是第37页，共108页n n特征特征特征特征（1 1 1 1）保留了）保留了）保留了）保留了pBR322pBR322pBR322pBR322的的的的和和和和筛选大肠杆菌克隆子筛选大肠杆菌克隆子筛选大肠杆菌克隆子筛选大肠杆菌克隆子（2 2 2 2）含）含）含）含URA3URA3URA3URA3标记标记标记标记筛选酵母菌克隆子筛选酵母菌克隆子筛选酵母菌克隆子

48、筛选酵母菌克隆子 （3 3 3 3）URA3URA3URA3URA3基因基因基因基因补偿酵母菌补偿酵母菌补偿酵母菌补偿酵母菌ura3ura3ura3ura3突变突变突变突变 n n优点优点优点优点（1 1 1 1）是一种穿梭质粒，可在酵母菌和大肠杆菌中复制）是一种穿梭质粒，可在酵母菌和大肠杆菌中复制）是一种穿梭质粒，可在酵母菌和大肠杆菌中复制）是一种穿梭质粒，可在酵母菌和大肠杆菌中复制（2 2 2 2）转化率高，）转化率高，）转化率高，）转化率高，1gDNA1gDNA1gDNA1gDNA可获得约可获得约可获得约可获得约101010104 4 4 4101010105 5 5 5个克隆子个克隆子

49、个克隆子个克隆子（3 3 3 3）稳定高拷贝复制）稳定高拷贝复制）稳定高拷贝复制）稳定高拷贝复制 故可用酵母菌高水平表达外源目的基因故可用酵母菌高水平表达外源目的基因故可用酵母菌高水平表达外源目的基因故可用酵母菌高水平表达外源目的基因现在学习的是第38页，共108页（六）（六）（六）（六）TATATATA克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体针对针对针对针对PCRPCRPCRPCR产物的克隆产物的克隆产物的克隆产物的克隆n n原理原理原理原理PCRPCRPCRPCR产物在产物在产物在产物在TaqTaqTaqTaq酶的非模板依赖活性酶的非模板依赖活性酶的非模板依赖活性酶的非模板依赖活性作用下，于作用下

50、，于作用下，于作用下，于3333端加一非配对的端加一非配对的端加一非配对的端加一非配对的A A A A。故可研制一种线性载体，其故可研制一种线性载体，其故可研制一种线性载体，其故可研制一种线性载体，其5555端各带一不配对端各带一不配对端各带一不配对端各带一不配对T T T T，可直接与，可直接与，可直接与，可直接与PCRPCRPCRPCR产物以产物以产物以产物以TATATATA连接进行克隆，即连接进行克隆，即连接进行克隆，即连接进行克隆，即TATATATA克隆。克隆。克隆。克隆。n nTATATATA载体的再生方法载体的再生方法载体的再生方法载体的再生方法（1 1 1 1）克隆载体线性化）克