药品微生物验证实例课件.ppt

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1、微生物限度检查法微生物限度检查法 验证实验要点及实例验证实验要点及实例标准化操作标准化操作方法选择方法选择样品处理样品处理冲洗方法和条件冲洗方法和条件中和剂加入中和剂加入菌液加入菌液加入标准化操作标准化操作冲洗方法冲洗方法 强调少量多次：强调少量多次：5050ml/ml/次；次；强调充分振摇；强调充分振摇；操作细节的标准规范，如集菌仪转速、冲洗过操作细节的标准规范，如集菌仪转速、冲洗过程中盖还是不盖滤筒下口等等。程中盖还是不盖滤筒下口等等。标准化操作标准化操作中和剂加入中和剂加入 不同中和剂加入方式可能效果不一样。通过我们的经验，基本倾向于直接加入培养基中效果最好。但如果某些中和剂对微生物生长

2、不利可考虑其他步骤加入。标准化操作标准化操作菌液加入菌液加入按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液，主要是考虑滤器的有效性。滤器的有效性应由提供企业控制，用户可采用适当方法抽查（如检查阳性菌液通过滤筒的流出液）。标准化操作标准化操作菌液加入菌液加入 而验证实验主要考虑滤膜/滤器残留抗菌物质对阳性菌生长的影响，可以与对照滤筒比较而做出判断，所以验证实验中加菌时机与方式只要与对照一致即可。验证实验的几个问题验证实验的几个问题微生物限度检查法验证实验要点微生物限度检查法验证实验要点验证实验实例微生物限度检查法验证实验要点微生物限度检查法验证实验要点样品样品菌种和实验用菌液（同无菌检查）菌种和实验用菌

3、液（同无菌检查）回收率测定实验回收率测定实验控制菌检查的验证控制菌检查的验证实验器材实验器材首先应是合格的样品。微生物限度检查样品微生物限度检查样品微生物限度检查样品微生物限度检查样品样品给药途径和类型决定何种控制菌检查验证样品给药途径和类型决定何种控制菌检查验证 一般口服制剂验证大肠埃希菌 外用制剂验证金葡和铜绿假单胞 含药材原粉；含豆豉、神曲等发酵成分的制剂的大肠菌群检查验证 含动物组织（包括提取物）含动物组织（包括提取物）口服制剂验证沙门菌 阴道给药制剂（中成药）验证梭菌抽样量抽样量和和检验量检验量分别单列一项。分别单列一项。抽抽样样量量 一一般般抽抽样样量量为为检检验验用用量量（2 2

4、个个以以上上最最小小包装）的包装）的3 3倍倍。检验量检验量 指供试品一次检验的用量。一般为指供试品一次检验的用量。一般为1010g g或或1010mlml；化学药膜剂为化学药膜剂为100100cmcm2 2；贵重或微量贵重或微量包装的药品可酌减（不得少于包装的药品可酌减（不得少于3 3g g）。）。检查沙门检查沙门菌的供试品其检验量改为菌的供试品其检验量改为1010g g或或1010mlml。验证实验按检验量执行。验证实验按检验量执行。微生物限度检查样品微生物限度检查样品微生物限度检查样品微生物限度检查样品制剂形式多样，决定前处理各异制剂形式多样，决定前处理各异 难溶固体制剂 非水溶性制剂

5、软膏、油膏 栓剂等 供供试试液液的的制制备备 制制备备供供试试液液所所用用的的乳乳化化剂剂、分分散散剂剂、中中和和剂剂及及其其用用量量应应验验证证，在在该该检验条件无抗菌作用。检验条件无抗菌作用。7 7类供试品供试液的制备，其中增订：类供试品供试液的制备，其中增订：微生物限度检查样品前处理微生物限度检查样品前处理非水溶性供试品非水溶性供试品 司盘司盘8080、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯8080 供供试试品品1010g g，20ml20ml无无菌菌十十四四烷烷酸酸异异丙丙酯酯和和无无菌菌玻玻璃璃珠珠，必必要要时时再再加加适适量量十十四四烷烷酸酸异异丙丙酯酯，充充分分振振摇

6、摇，使使供供试试品品溶溶解解。然然后后加加 4510045100ml ml pH7.0pH7.0蛋蛋白白胨胨氯氯化化钠钠缓缓冲冲液液，振振摇摇5-105-10分分钟钟，萃萃取取，待待油油水水分分层层后，取水层作为后，取水层作为1 1：1010供试液。供试液。微生物限度检查样品前处理微生物限度检查样品前处理 非水溶性膜剂供试品非水溶性膜剂供试品 化化学学药药膜膜剂剂取取100100cmcm2 2，剪剪碎碎，加加100100ml ml pH7.0pH7.0氯氯化化钠钠-蛋蛋白白胨胨缓缓冲冲液液，浸浸泡泡，振振摇摇，作作供供试试液液。一一部部中中药药膜膜剂剂取取50 50 cmcm2 2，剪剪碎碎，

7、加加适适量量的的pH7.0pH7.0氯氯化化钠钠-蛋蛋白白胨胨缓缓冲冲溶溶液液（5050或或100100mlml）浸浸泡泡，振振摇摇，以以供供试试品品浸浸液液为为供供试试液液。（SOP SOP 20002000版版规规定定:中中药药膜膜剂剂取取30-30-5050cmcm2 2 ，剪碎，加水剪碎，加水100100mlml）。）。微生物限度检查样品前处理微生物限度检查样品前处理 肠溶及结肠溶制剂肠溶及结肠溶制剂 供试品供试品1010g g，加加100100ml pH6.8ml pH6.8无菌磷酸盐缓冲液无菌磷酸盐缓冲液（肠溶制剂）或（肠溶制剂）或pH7.6pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（结肠无菌磷酸

8、盐缓冲液（结肠制剂）制剂）,于于4545水浴振摇，使溶解。水浴振摇，使溶解。微生物限度检查样品前处理微生物限度检查样品前处理 气雾剂、喷雾剂供试品气雾剂、喷雾剂供试品 取取规规定定量量供供试试品品，置置冷冷冻冻室室冷冷冻冻1 1h h，取取出出，迅迅速速消消毒毒供供试试品品开开启启部部位位周周围围，用用无无菌菌钢钢锥锥钻钻一一小小孔孔，放放置置室室温温，并并轻轻轻轻转转动动容容器器，使使抛抛射射剂剂全全部部抛抛出出。以以无无菌菌注注射射器器吸吸出出全全部部药药液液，按按标标示示量量加加稀稀释释剂剂至至足足量量（若若含含非非水水溶溶性性成成份份，加加适适量量无无菌菌聚聚山山梨梨酯酯-80-80液

9、液），使使匀匀，取取相相当当于于1010g g或或1010mlml的的供供试试品品，再稀释成再稀释成110110的供试液。的供试液。微生物限度检查样品前处理微生物限度检查样品前处理具抑菌活性的供试品具抑菌活性的供试品 供供试试品品接接种种至至较较大大量量的的培培养养基基中中。1 1mlml供供试试液液可可等等量量分分注注多多个个平平皿皿；控控制制菌菌检检查查，可可加加大大增增菌菌培培养养基基的的用用量量，或或采采用用薄薄膜膜过过滤法。滤法。离心集菌法离心集菌法 薄膜过滤法薄膜过滤法 微生物限度检查样品前处理微生物限度检查样品前处理微生物限度检查样品前处理微生物限度检查样品前处理目标是使不便于取

10、样的供试品分散均匀！目标是使不便于取样的供试品分散均匀！微生物限度检查法验证微生物限度检查法验证细菌、霉菌及酵母菌数计数方法验证细菌、霉菌及酵母菌数计数方法验证 定量回收率测定实验控制菌检查方法验证控制菌检查方法验证 定性能否生长、专属性实验 在建立供试品的细菌、霉菌和酵母菌计数方法或原法的检验条件有改变可能影响检验结果的准确性，应对检查法的可靠性进行验证。验证时做规定菌的回收试验，以判断供试品是否具有抗菌活性的实验方法。回收率测定实验回收率测定实验验验证证用用菌菌株株 大大肠肠杆杆菌菌、金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌、枯草芽孢杆菌、白色念株菌、黑曲霉。枯草芽孢杆菌、白色念株菌、黑曲霉。菌液制备

11、（同无菌检查法）。菌液制备（同无菌检查法）。取取培培养养物物用用无无菌菌氯氯化化钠钠溶溶液液稀稀释释成成1 1mlml含含5050100100cfucfu的菌液。的菌液。回收率测定实验回收率测定实验验证方法验证方法 试验组 取规定量最低稀释级的供试液，加入50100cfu的菌液，按平板菌落计数方法测定其菌数或薄膜过滤计数。菌液组 测定加入的试验菌液的菌数。供试品对照组 测定供试品稀释液（本底）的菌数。稀释剂对照组 取稀释液加入50100cfu的菌液，按供试品组供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。验证试验应独立平行进行3次，分别计算各次 试验菌的回收率。回收率测定实验回收率测定实验 回收率计

12、算回收率计算 试验组的菌回收率=（试验组平均菌落数供试品对 照 组 平 均 菌 落 数）/菌 液 组 平 均 菌 落 数 100%稀释剂对照组的菌回收率=（稀释剂对照组的平均 菌落数/菌液组的平均菌落数）100%回收率测定实验回收率测定实验结果判断结果判断 稀释剂对照组的菌回收率应大于70%。若试验组的菌回收率均大于70%，符合验证试验，可按此方法测定细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次平行试验中供试品组的菌回收率均小于70%，不符合验证试验，应建立新的检验方法，并重新验证。验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同 时进行。回收率测定实验回收率测定实验回收率测定实验回收率测定实验常规法（平皿法）

13、常规法（平皿法）薄膜过滤法薄膜过滤法回收率测定实验回收率测定实验常规法（平皿法）常规法（平皿法）在采用培养基稀释法时，应注意避 免在注皿前菌液和供试液直接接触；回收率测定实验回收率测定实验常规法（平皿法）常规法（平皿法）稀释法（0.5ml/皿；0.2ml/皿）每一平皿均应加1ml菌液。培养基稀释的表示：1:200；1:400；1:1000回收率测定实验回收率测定实验薄膜过滤法薄膜过滤法 菌液检验（计数）应与供试液同法处理，也要采用薄膜过滤法。在建立供试品的控制菌检查法或原法的检验条件有改变可能影响检验结果的准确性，应对检查法的可靠性进行验证。验证时做规定菌的回收试验，以判断供试品是否具有抗菌活

14、性的实验方法。控制菌检查方法验证控制菌检查方法验证验证用菌株验证用菌株 ：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌。菌液制备（同前）：菌液制备（同前）：用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1ml含10-100cfu。控制菌检查方法验证控制菌检查方法验证验证方法验证方法试验组：取规定量供试液及10100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，试验菌应加在最后一次冲洗液中，冲洗后，取出滤膜接入增菌培养基中。阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用

15、金黄色葡萄球菌；验证铜 绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查法时的阴性对照 菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。控制菌检查方法验证控制菌检查方法验证结果判定结果判定 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消 除供试品的抑菌活性，并重新验证。验证试验可与供试品的控制菌检查同 时进行。控制菌检查方法验证控制菌检查方法验证控制菌检查方法验证控制菌检查方法验证培养基稀释法薄膜过滤法大肠菌群的半定量实验器材实验器材微生物限度检查薄膜过滤器微生物限度

16、检查薄膜过滤器 经过无数次实验，开发出了成熟的微生物限度检查用薄膜滤器。安全、可靠、方便。采用75mm滤膜，菌落计数更清晰。无需转膜，直接用于控制菌检查。75mm薄膜薄膜过滤器过滤器75mm薄薄膜过滤器膜过滤器验证实验的几个问题验证实验的几个问题微生物限度检查法验证实验要点验证实验实例验证实验实例验证实验实例验证实验实例洁 身 泡 沫 剂供试液制备：取供试品，放置在-40低温冰柜中冷冻1-2小时，瓶内液体凝固取出，在无菌条件下迅速开启，将内容物取出放入无菌的三角烧瓶内，等内容物完全液化后，取供试液10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液至100ml，制成1:10的供试液。验证实验实例验

17、证实验实例氧氟沙星凝胶供试液制备：取供试品10g，加无菌的5氯化钙溶液10ml充分混合均匀，再加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1:10的供试液备用。验证实验实例验证实验实例复方醋酸地塞米松乳膏 供试液制备：取供试品10g，加45的无菌0.1吐温溶液至100ml，混匀，作为供试液。验证实验实例验证实验实例双唑泰软胶囊栓 称取样品10g，加PH7.0氯化钠-蛋白胨-聚山梨酯80的混和液100ml(水温为40)至100ml，浓度为1：10供试液。验证实验实例验证实验实例离心集菌薄膜过滤法取离心管上清液1ml加入薄膜过滤器中,冲洗300ml/膜,另取1ml上述5种试验菌株，加入平

18、皿中，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌加营养琼脂培养基20 ml，白色念珠菌和黑曲霉菌玫瑰红钠琼脂20 ml,待凝固后，再取膜贴于琼脂平板,置规定温度培养 2472小时观察结果，细菌计数，测 定回收率。验证实验实例验证实验实例黄连上清片 取供试品10g，置均质器中充分混匀后加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1:10的供试液。验证实验实例验证实验实例富马酸酮替酚滴鼻液富马酸酮替酚滴鼻液 控制菌控制菌 需检查需检查大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌菌验证实验实例验证实验实例西洛他唑缓释片按药典规定供试液应为1：10但此缓释片配成1：

19、10供试液时，其粘稠度过大，不利于吸取供试液，所以将此类药物配制成1：20供试液。验证实验实例验证实验实例调补肺肾胶囊 此药品中含有动物组织控制菌需做沙门菌的检查 在验证试验中我们发现此药品抑制沙门菌，用稀释法10g加入到1000ml营养肉汤中，阳性菌才生长。验证实验实例验证实验实例玉屏风软胶囊玉屏风软胶囊 此药品此药品软胶囊软胶囊中的液体含有一定的油中的液体含有一定的油脂，配制脂，配制1：10的供试液时油脂浮在水面上，不利的供试液时油脂浮在水面上，不利于取样，所以在配制供试液时，用于取样，所以在配制供试液时，用45的无菌的无菌0.1%聚酸梨酯聚酸梨酯80溶液。溶液。验证实验实例验证实验实例

20、供试品 供试液10ml(相当于供试品1g、1ml)80 10min 迅速冷却|100ml 0.1%疱肉培养基 3537 厌氧7296h 产气、碎肉消化恶臭 不产气、无消化碎肉，无恶臭 0.2ml 涂抹 含庆大霉素的哥伦比亚琼脂平板 3537 厌氧4872h 报告 有菌落生长 无菌落生长 过氧化氢酶试验，镜检 报告 过氧化氢酶阴性，革兰阳性梭菌 非左述反应 报告检出 报告未检出根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜 的方法制备供试液。供试液制备若需用水浴加的方法制备供试液。供试液制备若需用水浴加 温时，温度不应超过温时，温度不应超过4545。供试液从制备至加入。供试液从制备至加入 检验用培养基，不得超过检验用培养基，不得超过1 1小时。小时。谢谢大家！谢谢大家！