药品微生物限度与无菌检查方法验证实验的要点及体会.ppt

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1、药品微生物限度与无菌检查药品微生物限度与无菌检查方法验证实验的要点及体会方法验证实验的要点及体会中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所马仕洪马仕洪北京北京 2007年年1月月 web site: e-mail: tel:010-67095509 地址：北京市天坛西里地址：北京市天坛西里2 2号号 邮编：邮编：100050100050 一、方法验证实验的背景及程序一、方法验证实验的背景及程序1、关于方法验证（背景）、关于方法验证（背景）2、方法验证实验的一般原则和程序2023/1/202中国药品生物制品检定所1、关于方法验证（背景）、关于方法验证（背景）中国药典2005版国食监注20052

2、34号“关于颁布和执行中国药典2005年版有关事宜的通知”国药典发200598号“关于执行中国药典2005年版微生物限度检查法和无菌检查法有关问题的说明”中检药2006862号“第七届全国药品检验所抗生素室主任工作会议暨全国药品微生物检验方法及标准研讨会会议纪要”2023/1/203中国药品生物制品检定所为什么验证为什么验证?1）、采用经过验证的方法，是分析测量科学的基本要求，是各种法规遵循工作的基础。药品微生物检查作为整个药品质量体系中的一个环节，应与其他检验项目一样，对方法和条件进行考察，以保证结果的科学性，如鉴别、含量测定。2）、验证的思想其实早已贯彻于微生物检测的诸多方面：无菌环境验证

3、（尘埃离子、浮游菌、沉降菌检测）、灭菌器的验证、培养基灵敏度检测、阴性对照、阳性对照等等。2023/1/204中国药品生物制品检定所为什么验证为什么验证?3）、2005版充分借鉴发达国家经验，将微生物检查方法的验证实验进行了更加系统化的规定和要求。验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每一个环节均应有合理的证明（验证），保证其对结果判断没有影响。4）、有了系统的方法验证，可以避免以往因为阳性菌选择不合理、方法不合理而造成的漏检、误判，以保证结果的科学可靠，这一点无论对于当前无菌检查的一次性报告，还是对于实验室认证认可、以及新的药品注册管理办法的要求都是相一致的。2023/1/205中国药品

4、生物制品检定所为什么验证？为什么验证？5）、验证的必要性（质量控制的新手段）：）、验证的必要性（质量控制的新手段）：不同企业以及同企业不同批次黄连上清丸稀释法的回收率比较试验结果，可能反映了不同黄连上清丸样品的质量差异。2023/1/206中国药品生物制品检定所表表5 5 七企业黄连上清丸稀释法的回收率比较实验结果七企业黄连上清丸稀释法的回收率比较实验结果Tab 1 Recovery of dilute method in microbiological test of huanglianshangqingwan from 7 corporations2023/1/207中国药品生物制品检定所

5、表表6 同厂不同批黄同厂不同批黄连上清丸稀上清丸稀释法的回收率比法的回收率比较实验结果（果（1：200）Tab 2 recoverice of dilute method in microbiological test of huanglianshangqingwan from different batchs in same corporation(1:200)2023/1/208中国药品生物制品检定所2、方法验证实验的一般原则和程序、方法验证实验的一般原则和程序验证什么？验证什么？怎么验证？怎么验证？2023/1/209中国药品生物制品检定所验证什么？验证什么？微生物检验：某种样品样品采用

6、某种方法方法得到一个检查结果结果。What？供试品影响供试品影响方法的有效性方法的有效性2023/1/2010中国药品生物制品检定所验证什么？验证什么？需前处理需前处理不需前处理不需前处理有抑菌作用有抑菌作用无抑菌作用无抑菌作用样品样品检查检查去除抑菌作用去除抑菌作用验证前处理方法对污染菌生长、检出的影响。验证前处理方法对污染菌生长、检出的影响。验证抑菌活性去除的有验证抑菌活性去除的有效性，以及去除方法对污效性，以及去除方法对污染菌生长、检出的影响。染菌生长、检出的影响。可以通过验可以通过验证实验判断证实验判断 图图1 1 药品微生物检查方法验证的一般程序与环节药品微生物检查方法验证的一般程序

7、与环节What？2023/1/2011中国药品生物制品检定所验证什么？验证什么？需要验证的重点环节需要验证的重点环节验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每一个环节均应有合理的证明（验证），保证其对结果判断没有影响。前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应在验证范围内。已有标准规程（SOP）和充足实验证明的前处理方法可以直接采用，但出现疑问应进一步研究但出现疑问应进一步研究提高。提高。供试品中抗菌活性的去除是当前验证工作的重点。供试品中抗菌活性的去除是当前验证工作的重点。尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。2023/1/2012中国药

8、品生物制品检定所方法疑问实例方法疑问实例菌在何处？菌在何处？金葡金葡1010-6-6大肠大肠1010-6-6铜绿铜绿1010-6-6枯草枯草1010-5-5白念白念1010-5-5黑曲霉黑曲霉1010-4-4不离心菌悬液计数不离心菌悬液计数39392323474713139393100100离心管上部菌悬液计数离心管上部菌悬液计数252523236262181827273131离心管中部菌悬液计数离心管中部菌悬液计数272720204040151547473333离心管下部菌悬液计数离心管下部菌悬液计数303021214949121227276464表表7 10ml7 10ml菌悬液菌悬液50

9、0r/min500r/min离心离心5min5min离心后离心管不同部位菌悬液的计数结果（离心后离心管不同部位菌悬液的计数结果（cfu/mLcfu/mL）离心集菌法：离心集菌法：500r/min500r/min离心离心5min5min r/min=r/min=g g？2023/1/2013中国药品生物制品检定所怎么验证？怎么验证？利用供试品与微生物的差异，降低或消除供试品的影响，通过模拟实验对降低或消除效果加以检验。How?2023/1/2014中国药品生物制品检定所稀释法稀释法薄膜法薄膜法中和法中和法离心法离心法供试品供试品前处理前处理去除抗菌活性去除抗菌活性稀释稀释溶解溶解分散分散萃取萃取

10、离心离心供试品污染微生物检查供试品污染微生物检查验证验证2023/1/2015中国药品生物制品检定所供试品中抗菌活性的去除供试品中抗菌活性的去除稀释法稀释法降低供试品的相对浓度降低供试品的相对浓度薄膜法薄膜法利用体积差异分离利用体积差异分离中和法中和法利用化学（生物）专属性灭利用化学（生物）专属性灭活活离心法离心法利用沉降系数差异分离利用沉降系数差异分离 各方法组合运用，效果更佳！各方法组合运用，效果更佳！2023/1/2016中国药品生物制品检定所抗菌活性去除效果的检验抗菌活性去除效果的检验应根据供试品的特点，选择敏感菌株选择敏感菌株，对供试品抗菌活性去除效果加以检验（阳性菌的回收实验），再

11、按药典要求全面验证，提高效率。2023/1/2017中国药品生物制品检定所选择敏感菌株选择敏感菌株 间接方法间接方法文献、技术资料（可靠）文献、技术资料（可靠）直接方法直接方法预实验（体外抑菌实验）预实验（体外抑菌实验）参考选择：参考选择：一般中药选择枯草和金葡；一般中药选择枯草和金葡；一般抗生素根据抗菌谱选择。一般抗生素根据抗菌谱选择。2023/1/2018中国药品生物制品检定所药物名称药物名称生产企业生产企业大肠大肠大肠大肠金葡金葡金葡金葡枯草枯草枯草枯草白念白念白念白念黑曲黑曲黑曲黑曲抗栓再造丸抗栓再造丸辽宁华鑫药业有限公司辽宁华鑫药业有限公司100 100 100 100 45 45

12、45 45 46 46 46 46 100 100 100 100 95 95 95 95 更年安胶囊更年安胶囊福州金象中药药业有限公司福州金象中药药业有限公司87 87 87 87 95 95 95 95 41 41 41 41 100 100 100 100 91 91 91 91 清热安宫丸清热安宫丸江西国药药业有限公司江西国药药业有限公司88 88 88 88 14 14 14 14 15 15 15 15 100 100 100 100 92 92 92 92 通宣理肺丸通宣理肺丸广东阳江制药厂广东阳江制药厂100 100 100 100 59 59 59 59 1001001001

13、00 100 100 100 100 100 100 100 100 肝德志胶囊肝德志胶囊四川省通阳制药厂四川省通阳制药厂93 93 93 93 64 64 64 64 41 41 41 41 100 100 100 100 100 100 100 100 宁心安神胶囊宁心安神胶囊广西南宁万士达制药厂广西南宁万士达制药厂100 100 100 100 7070707070707070100 100 100 100 100 100 100 100 防癌胶囊防癌胶囊北京北卫药业有限公司北京北卫药业有限公司35 35 35 35 52 52 52 52 70707070100 100 100 100

14、 81 81 81 81 肠胃舒胶囊肠胃舒胶囊北京北卫药业有限公司北京北卫药业有限公司73 73 73 73 22 22 22 22 47 47 47 47 100 100 100 100 86 86 86 86 骨络通酒骨络通酒北京北卫药业有限公司北京北卫药业有限公司100 100 100 100 7 7 7 7 61 61 61 61 100 100 100 100 92 92 92 92 消渴丸消渴丸北京北卫药业有限公司北京北卫药业有限公司93 93 93 93 1 1 1 1 67 67 67 67 100 100 100 100 88 88 88 88 鼻渊丸鼻渊丸武汉中联药业集团公

15、司武汉中联药业集团公司80 80 80 80 0 0 0 0 51 51 51 51 100 100 100 100 100 100 100 100 陀螺银屑胶囊陀螺银屑胶囊烟台中洲制药厂烟台中洲制药厂100 100 100 100 7070707070707070100 100 100 100 100 100 100 100 冠心丹参胶囊冠心丹参胶囊内蒙古自治区包头制药厂内蒙古自治区包头制药厂89 89 89 89 0 0 0 0 0 0 0 0 100 100 100 100 100 100 100 100 龟龄集龟龄集山西广誉远园药业有限公司山西广誉远园药业有限公司100 100 100

16、 100 7070707070707070100 100 100 100 100 100 100 100 肚痛健胃整肠丸肚痛健胃整肠丸香港康恩堂制药厂香港康恩堂制药厂83 83 83 83 7070707070707070100 100 100 100 100 100 100 100 冠心丹参胶囊冠心丹参胶囊长春海王生物制药有限公司长春海王生物制药有限公司100 100 100 100 7070707070707070100 100 100 100 100 100 100 100 糖尿乐胶囊糖尿乐胶囊哈尔滨中药六厂有限公司哈尔滨中药六厂有限公司100 100 100 100 707070707

17、0707070100 100 100 100 100 100 100 100 降糖宁胶囊降糖宁胶囊通化茂祥制药有限公司通化茂祥制药有限公司100 100 100 100 7070707070707070100 100 100 100 100 100 100 100 温胃舒胶囊温胃舒胶囊江苏聚荣制药有限公司江苏聚荣制药有限公司707070707070707070707070100 100 100 100 100 100 100 100 表8 选选择择敏敏感感菌菌株株2023/1/2019中国药品生物制品检定所二、方法验证实验的几个要点二、方法验证实验的几个要点1、无菌检查法验证实验要点、无菌检查

18、法验证实验要点2、微生物限度检查法验证实验要点3、验证实验实例2023/1/2020中国药品生物制品检定所1、无菌检查法验证实验要点、无菌检查法验证实验要点样品样品菌种和实验用菌液菌种和实验用菌液标准化操作标准化操作实验器材实验器材2023/1/2021中国药品生物制品检定所无菌检查样品无菌检查样品无无菌菌检检查查样样品品取样量取样量（量）（量）样品特性样品特性（质）（质）抗菌活性抗菌活性剂型剂型检验数量检验数量检验量检验量侧重验证实验侧重验证实验侧重无菌检查侧重无菌检查敏感菌选择敏感菌选择去除抗菌活去除抗菌活性方法选择性方法选择前处理方法前处理方法2023/1/2022中国药品生物制品检定所

19、无菌检查样品无菌检查样品主要是取样量的问题主要是取样量的问题中国药典中国药典20052005年版对无菌检查的年版对无菌检查的“检验数量检验数量”和和“检验量检验量”作了明确的解作了明确的解释和规定。释和规定。2023/1/2023中国药品生物制品检定所表表2 2中上市抽验样品（液体制剂）的最少检验量中上市抽验样品（液体制剂）的最少检验量供试品装量供试品装量V V(ml)(ml)每支样品接入每管培每支样品接入每管培养基的最少样品量养基的最少样品量最少检验数量最少检验数量(瓶或支瓶或支)1 1 1V5 1V5 5 V20 5 V20 20 V50 20 V50 50 V100 50 V100 50

20、 V100(50 V500 V500全量全量半量半量2ml2ml5ml5ml10ml10ml半量半量半量半量500ml500ml20*20*101010101010101010106 66 6*每种培养基各接种每种培养基各接种1010支供试品支供试品2023/1/2024中国药品生物制品检定所 表表3 3中上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量中上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量 供试品装量M/支、瓶或个每支样品接入每管培养基的最小样品量最少检验数量（瓶或支）M50mg 50mgM300mg 300mgM5g M5g 外科用敷料棉花及纱布 缝合线、一次性医用材料 带导管的一次性医疗器具（如输液

21、袋）其它医疗器具 全量 半量 150mg 500mg 取100mg或1cm3cm 整个材料*3整个器具*3（切碎 或拆散开）20*11010 10*210 20*110 20*12023/1/2025中国药品生物制品检定所表3注释*1：每种培养基各接种10支供试品。*2：抗生素粉针剂(5g)及抗生素原料药(5g)的最少检验数量为6瓶(或支)，桶装固体原料的检验数量为4个包装。*3：如果医用器械体积过大，培养基用量可在2000ml以上，将其完全浸没。2023/1/2026中国药品生物制品检定所无菌检查样品无菌检查样品 三点体会：一是附录规定检验量的表格中不包括阳性对照用样品量，虽然附录另处有专门

22、说明，仍然容易忽略；2023/1/2027中国药品生物制品检定所无菌检查样品无菌检查样品 三点体会：二是无菌检查时应强调“检验数量”，主要是保证实验结果的代表性，而阳性对照实验和验证实验仅须满足“检验量”总量要求即可，以检验样品对实验结果的影响，即保证实验结果的可靠性，验证实验可以由此减少大量的样品；2023/1/2028中国药品生物制品检定所无菌检查样品无菌检查样品 三点体会：三是对“检验数量”和“检验量”的把握应考虑便于实际操作，比如处理100ml/袋的样品，取9袋样品一次分配到一组三联滤器，“检验数量”大于药典规定的6个，但“检验量”似乎不符合药典规定的每袋样品取半量检验的规定，仅为1/

23、3，但根据药典“检验量”即为“一次实验所用供试品的总量（g或ml）”的解释，这与先将6袋分配两个滤筒、再将剩下3袋抽入一个滤筒作为阳性对照的方法一样，却更节省时间。2023/1/2029中国药品生物制品检定所菌种和实验用菌液菌种和实验用菌液枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 Bacillus Bacillus subtilissubtilis CMCCCMCC（B B）63 50163 501金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 Staphylococcus Staphylococcus aureusaureus CMCCCMCC（B B）26 00326 003生孢梭菌生孢梭菌 Clostridium Clo

24、stridium sporogenessporogenes CMCCCMCC（B B）64 94164 941铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 Pseudomonas Pseudomonas aeruginosaaeruginosa CMCC CMCC（B B）10 10410 104大肠埃希菌大肠埃希菌 Escherichia coliEscherichia coli CMCCCMCC（B B）44 10244 102白色念珠菌白色念珠菌 Candida Candida albicansalbicans CMCCCMCC（F F）98 00198 001黑曲霉黑曲霉 AspergillusAsper

25、gillus nigerniger CMCCCMCC（F F）98 00398 0032023/1/2030中国药品生物制品检定所菌种和实验用菌液菌种和实验用菌液验证用菌种的保藏 使用频繁 传代限制（5代）2023/1/2031中国药品生物制品检定所菌种和实验用菌液菌种和实验用菌液 菌种保藏及应用参考方法：菌种保藏及应用参考方法：干菌种（0 0代）代）100ml液体培养基复苏（1 1代）代）100ml液体培养基复壮（2 2代）代）加100ml 20%无菌甘油混匀，1ml/管冻存管分装，-20或-80保存 每次使用取1支自然（室温）解冻，取0.1ml接种至10ml液体培养基（生孢梭菌用12ml硫

26、乙醇酸盐流体培养基）按规定培养、稀释（3 3代）代）注意：已经解冻的冻存管不能再冷冻保存，以免冻融！注意：已经解冻的冻存管不能再冷冻保存，以免冻融！2023/1/2032中国药品生物制品检定所菌种和实验用菌液菌种和实验用菌液各实验室应根据自身操作习惯总结出一套切实可行、快速稳定的菌液制备标准程序。2023/1/2033中国药品生物制品检定所菌种和实验用菌液菌种和实验用菌液参考菌液制备标准程序：参考菌液制备标准程序：取经34培养18-24小时的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、绿假单胞菌与大肠埃希菌的营养肉汤培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，分别10倍稀释备用（枯草芽孢杆菌至10-

27、5、金黄色葡萄球菌10-6、绿假单胞菌与大肠埃希菌至10-7）；2023/1/2034中国药品生物制品检定所菌种和实验用菌液菌种和实验用菌液参考菌液制备标准程序：参考菌液制备标准程序：取经34培养1824小时的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-7备用；2023/1/2035中国药品生物制品检定所菌种和实验用菌液菌种和实验用菌液参考菌液制备标准程序：参考菌液制备标准程序：取经24 培养1824小时的白色念珠菌改良马丁培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5备用；2023/1/2036中国药品生物制品检定所菌

28、种和实验用菌液菌种和实验用菌液参考菌液制备标准程序：参考菌液制备标准程序：取经培养一周的黑曲霉菌改良马丁琼脂斜面培养物，加0.9%无菌氯化钠溶液5ml，洗下孢子，转移至另一空管，加0.9%无菌氯化钠溶液至与标准比浊管浊度相当后，取1ml加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-4备用。2023/1/2037中国药品生物制品检定所菌种和实验用菌液菌种和实验用菌液关于黑曲霉：关于黑曲霉：转种操作应在超净工作台（或相当此环境）中进行，关闭风机，靠近酒精灯操作；置2328培养57日，培养斜面形态可参照下图；转种完毕的冻存管和使用过的器具应经121湿热灭菌30分钟再作处理；2023/1/2

29、038中国药品生物制品检定所菌种和实验用菌液菌种和实验用菌液关于黑曲霉：关于黑曲霉：黑曲霉孢子相当稳定，可以保存于4 0.9%氯化钠溶液中较长时间，作为孢子悬液储备液使用。由此可以减少菌液制备工作量和反复操作黑曲霉的风险。2023/1/2039中国药品生物制品检定所菌种和实验用菌液菌种和实验用菌液菌液检验：菌液检验：结合验证实验方法进行活菌计数。生孢梭菌可在同步硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度实验中计数。2023/1/2040中国药品生物制品检定所标准化操作标准化操作方法选择方法选择样品处理样品处理冲洗方法和条件冲洗方法和条件中和剂加入中和剂加入菌液加入菌液加入2023/1/2041中国药品生物制品

30、检定所标准化操作标准化操作方法选择方法选择 取样量大于取样量大于5ml/支直接接种法不再适用；支直接接种法不再适用；除非样品不许可（难溶解），发展趋势应除非样品不许可（难溶解），发展趋势应采用全封闭的薄膜过滤法。采用全封闭的薄膜过滤法。2023/1/2042中国药品生物制品检定所标准化操作标准化操作样品处理样品处理 主要强调固体样品的溶解、转移、均匀分配问题。主要强调固体样品的溶解、转移、均匀分配问题。通常将规定取样量全部转移到通常将规定取样量全部转移到400500ml稀释剂稀释剂或者适宜溶液，再进行分配。或者适宜溶液，再进行分配。各厂家均专门开发有固体制剂（粉针）专用滤器，各厂家均专门开发有

31、固体制剂（粉针）专用滤器，我们提出了更为简便的无菌三针单联管。我们提出了更为简便的无菌三针单联管。2023/1/2043中国药品生物制品检定所标准化操作标准化操作冲洗方法冲洗方法 强调少量多次：强调少量多次：50ml/次；次；强调充分振摇；强调充分振摇；操作细节的标准规范，如集菌仪转速、冲操作细节的标准规范，如集菌仪转速、冲洗过程中盖还是不盖滤筒下口等等。洗过程中盖还是不盖滤筒下口等等。2023/1/2044中国药品生物制品检定所标准化操作标准化操作菌液加入菌液加入 菌液组、供试品加菌液组严格一致。菌液组、供试品加菌液组严格一致。生孢梭菌的加入生孢梭菌的加入 2023/1/2045中国药品生物

32、制品检定所标准化操作标准化操作中和剂加入中和剂加入 不同中和剂加入方式可能效果不一样。通过我们的经验，基本倾向于直接加入培养基中效果最好。但如果某些中和剂对微生物生长不利可考虑其他步骤加入。2023/1/2046中国药品生物制品检定所标准化操作标准化操作菌液加入菌液加入按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液，主要是考虑滤器的有效性。滤器的有效性应由提供企业控制，用户可采用适当方法抽查（如检查阳性菌液通过滤筒的流出液）。2023/1/2047中国药品生物制品检定所标准化操作标准化操作菌液加入菌液加入 而验证实验主要考虑滤膜/滤器残留抗菌物质对阳性菌生长的影响，可以与对照滤筒比较而做出判断，所以验

33、证实验中加菌时机与方式只要与对照一致即可。2023/1/2048中国药品生物制品检定所实验器材实验器材药品无菌检查最关键的器材是一次性过滤器，价格和质量影响应用。近期主要考虑安全可靠、使用方便、物美价廉。远期应进一步考虑低残留、低吸附等。2023/1/2049中国药品生物制品检定所实验器材实验器材关于实验器材问题，我们认为引入竞争、改进设计、推广应用，使产量、质量和用量稳步增长，成本和价格下降，使用户和企业双赢，有利于促进无菌检查方法更加规范和科学。2023/1/2050中国药品生物制品检定所2、微生物限度检查法验证实验要点、微生物限度检查法验证实验要点样品样品菌种和实验用菌液（同无菌检查）菌

34、种和实验用菌液（同无菌检查）回收率测定实验回收率测定实验控制菌检查的验证控制菌检查的验证实验器材实验器材2023/1/2051中国药品生物制品检定所首先应是合格的样品。微生物限度检查样品微生物限度检查样品2023/1/2052中国药品生物制品检定所微生物限度检查样品微生物限度检查样品样品给药途径和类型决定何种控制菌检样品给药途径和类型决定何种控制菌检查验证查验证 一般口服制剂验证大肠埃希菌 外用制剂验证金葡和铜绿假单胞 含药材原粉；含豆豉、神曲等发酵成分的制剂的大肠菌群检查验证2023/1/2053中国药品生物制品检定所抽样量和检验量分别单列一项。抽样量和检验量分别单列一项。抽抽样样量量 一一

35、般般抽抽样样量量为为检检验验用用量量（2 2个个以以上上最最小小包装）的包装）的3 3倍。倍。检验量检验量 指供试品一次检验的用量。一般为指供试品一次检验的用量。一般为1010g g或或1010mlml；化学药膜剂为化学药膜剂为100100cmcm2 2；贵重或微量贵重或微量包装的药品可酌减（不得少于包装的药品可酌减（不得少于3 3g g）。）。检查沙门检查沙门菌的供试品其检验量改为菌的供试品其检验量改为1010g g或或1010mlml。验证实验按检验量执行。验证实验按检验量执行。微生物限度检查样品微生物限度检查样品2023/1/2054中国药品生物制品检定所微生物限度检查样品微生物限度检查

36、样品制剂形式多样，决定前处理各异制剂形式多样，决定前处理各异 难溶固体制剂 非水溶性制剂 软膏、油膏 栓剂等2023/1/2055中国药品生物制品检定所 供供试试液液的的制制备备 制制备备供供试试液液所所用用的的乳乳化化剂剂、分分散散剂剂、中中和和剂剂及及其其用用量量应应验验证证，在在该该检验条件无抗菌作用。检验条件无抗菌作用。7 7类供试品供试液的制备，其中增订：类供试品供试液的制备，其中增订：微生物限度检查样品前处理微生物限度检查样品前处理2023/1/2056中国药品生物制品检定所非水溶性供试品非水溶性供试品 司盘司盘8080、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯8080

37、供供试试品品1010g g，20ml20ml无无菌菌十十四四烷烷酸酸异异丙丙酯酯和和无无菌菌玻玻璃璃珠珠，必必要要时时再再加加适适量量十十四四烷烷酸酸异异丙丙酯酯，充充分分振振摇摇，使使供供试试品品溶溶解解。然然后后加加4510045100ml ml pH7.0pH7.0蛋蛋白白胨胨氯氯化化钠钠缓缓冲冲液液，振振摇摇5-105-10分分钟钟，萃萃取取，待待油油水水分分层层后后，取水层作为取水层作为1 1：1010供试液。供试液。微生物限度检查样品前处理微生物限度检查样品前处理2023/1/2057中国药品生物制品检定所 非水溶性膜剂供试品非水溶性膜剂供试品 二二部部未未变变动动，化化学学药药膜

38、膜剂剂取取100100cmcm2 2，剪剪碎碎，加加100100ml ml pH7.0pH7.0氯氯化化钠钠-蛋蛋白白胨胨缓缓冲冲液液，浸浸泡泡，振振摇摇，作作供供试试液液。一一部部中中药药膜膜剂剂取取50 50 cmcm2 2，剪剪碎碎，加加适适量量的的pH7.0pH7.0氯氯化化钠钠-蛋蛋白白胨胨缓缓冲冲溶溶液液（5050或或100100mlml）浸浸泡泡，振振摇摇，以以供供试试品品浸浸液液为为供供试试液液。（SOP SOP 20002000版版规规定定:中中药药膜膜剂剂取取30-30-5050cmcm2 2 ，剪碎，加水剪碎，加水100100mlml）。）。微生物限度检查样品前处理微生物

39、限度检查样品前处理2023/1/2058中国药品生物制品检定所 肠溶及结肠溶制剂肠溶及结肠溶制剂 供试品供试品1010g g，加加100100ml pH6.8ml pH6.8无菌磷酸盐缓冲液无菌磷酸盐缓冲液（肠溶制剂）或（肠溶制剂）或pH7.6pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（结肠无菌磷酸盐缓冲液（结肠制剂）制剂）,于于4545水浴振摇，使溶解。水浴振摇，使溶解。微生物限度检查样品前处理微生物限度检查样品前处理2023/1/2059中国药品生物制品检定所 气雾剂、喷雾剂供试品气雾剂、喷雾剂供试品 取取规规定定量量供供试试品品，置置冷冷冻冻室室冷冷冻冻1 1h h，取取出出，迅迅速速消消毒毒供供试试品

40、品开开启启部部位位周周围围，用用无无菌菌钢钢锥锥钻钻一一小小孔孔，放放置置室室温温，并并轻轻轻轻转转动动容容器器，使使抛抛射射剂剂全全部部抛抛出出。以以无无菌菌注注射射器器吸吸出出全全部部药药液液，按按标标示示量量加加稀稀释释剂剂至至足足量量（若若含含非非水水溶溶性性成成份份，加加适适量量无无菌菌聚聚山山梨梨酯酯-8080液液），使使匀匀，取取相相当当于于1010g g或或1010mlml的的供供试试品品，再再稀释成稀释成110110的供试液。的供试液。微生物限度检查样品前处理微生物限度检查样品前处理2023/1/2060中国药品生物制品检定所具抑菌活性的供试品具抑菌活性的供试品 供供试试品品

41、接接种种至至较较大大量量的的培培养养基基中中。1 1mlml供供试试液液可可等等量量分分注注多多个个平平皿皿；控控制制菌菌检检查查，可可加加大大增增菌菌培养基的用量，或采用薄膜过滤法。培养基的用量，或采用薄膜过滤法。离心集菌法离心集菌法 薄膜过滤法薄膜过滤法 微生物限度检查样品前处理微生物限度检查样品前处理2023/1/2061中国药品生物制品检定所微生物限度检查样品前处理微生物限度检查样品前处理很有用处的低速离心法（500r/min X 5min）阿奇霉素缓释干混悬剂 红霉素片2023/1/2062中国药品生物制品检定所微生物限度检查样品前处理微生物限度检查样品前处理制剂形式多样，决定前处理

42、各异制剂形式多样，决定前处理各异目标是使不便于取样的供试品分散均匀！目标是使不便于取样的供试品分散均匀！2023/1/2063中国药品生物制品检定所微生物限度检查法验证微生物限度检查法验证细菌、霉菌及酵母菌数计数方法验证细菌、霉菌及酵母菌数计数方法验证 定量回收率测定实验控制菌检查方法验证控制菌检查方法验证 定性能否生长、专属性实验2023/1/2064中国药品生物制品检定所在建立供试品的细菌、霉菌和酵母菌计数方法或原法的检验条件有改变可能影响检验结果的准确性，应对检查法的可靠性进行验证。验证时做规定菌的回收试验，以判断供试品是否具有抗菌活性的实验方法。回收率测定实验回收率测定实验2023/1

43、/2065中国药品生物制品检定所验验证证用用菌菌株株 大大肠肠杆杆菌菌、金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌、枯枯草草芽孢杆菌、白色念株菌、黑曲霉。芽孢杆菌、白色念株菌、黑曲霉。菌液制备（同无菌检查法）。菌液制备（同无菌检查法）。取取培培养养物物用用无无菌菌氯氯化化钠钠溶溶液液稀稀释释成成1 1mlml含含5050100100cfucfu的菌液。的菌液。回收率测定实验回收率测定实验2023/1/2066中国药品生物制品检定所验证方法验证方法 试验组 取规定量最低稀释级的供试液，加入50100cfu的菌液，按平板菌落计数方法测定其菌数或薄膜过滤计数。菌液组 测定加入的试验菌液的菌数。供试品对照组 测定供

44、试品稀释液（本底）的菌数。稀释剂对照组 取稀释液加入50100cfu的菌液，按供试品组供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。验证试验应独立平行进行3次，分别计算各次试验菌的回收率。回收率测定实验回收率测定实验2023/1/2067中国药品生物制品检定所 回收率计算回收率计算 试验组的菌回收率=（试验组平均菌落数供试品对 照 组 平 均 菌 落 数）/菌 液 组 平 均 菌 落 数 100%稀释剂对照组的菌回收率=（稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数）100%回收率测定实验回收率测定实验2023/1/2068中国药品生物制品检定所结果判断结果判断 稀释剂对照组的菌回收率应大于70%。

45、若试验组的菌回收率均大于70%，符合验证试验，可按此方法测定细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次平行试验中供试品组的菌回收率均小于70%，不符合验证试验，应建立新的检验方法，并重新验证。验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。回收率测定实验回收率测定实验2023/1/2069中国药品生物制品检定所回收率测定实验回收率测定实验常规法（平皿法）常规法（平皿法）薄膜过滤法薄膜过滤法2023/1/2070中国药品生物制品检定所回收率测定实验回收率测定实验常规法（平皿法）常规法（平皿法）在采用培养基稀释法时，应注意避免在注皿前菌液和供试液直接接触；2023/1/2071中国药品生物制品检定所回收率

46、测定实验回收率测定实验常规法（平皿法）常规法（平皿法）稀释法（0.5ml/皿；0.2ml/皿）每一平皿均应加1ml菌液。培养基稀释的表示：1:200；1:400；1:10002023/1/2072中国药品生物制品检定所回收率测定实验回收率测定实验薄膜过滤法薄膜过滤法 菌液检验（计数）应与供试液同法处理，也要采用薄膜过滤法。2023/1/2073中国药品生物制品检定所 在建立供试品的控制菌检查法或原法的检验条件有改变可能影响检验结果的准确性，应对检查法的可靠性进行验证。验证时做规定菌的回收试验，以判断供试品是否具有抗菌活性的实验方法。控制菌检查方法验证控制菌检查方法验证2023/1/2074中国

47、药品生物制品检定所验证用菌株验证用菌株 ：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌。菌液制备（同前）：菌液制备（同前）：用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1ml含10-100cfu。控制菌检查方法验证控制菌检查方法验证2023/1/2075中国药品生物制品检定所验证方法验证方法试验组：取规定量供试液及10100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，试验菌应加在最后一次冲洗液中，冲洗后，取出滤膜接入增菌培养基中。阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴

48、性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。控制菌检查方法验证控制菌检查方法验证2023/1/2076中国药品生物制品检定所结果判定结果判定 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。控制菌检查方法验证控制菌检查方法验证2023/1/2077中国药品生物制品检定所控制菌检查方法验证控制菌检查方法

49、验证培养基稀释法薄膜过滤法大肠菌群的半定量2023/1/2078中国药品生物制品检定所实验器材实验器材微生物限度检查薄膜过滤器微生物限度检查薄膜过滤器 经过无数次实验，开发出了成熟的微生物限度检查用薄膜滤器。安全、可靠、方便。采用75mm滤膜，菌落计数更清晰。无需转膜，直接用于控制菌检查。2023/1/2079中国药品生物制品检定所3、几个微生物限度检查法的验证、几个微生物限度检查法的验证序号序号检品名称检品名称供试液制备供试液制备细菌计数细菌计数霉菌计数霉菌计数控制菌检查控制菌检查1氨酚氢可酮口服液取原液作为供试液常规法常规法常规法2复方地塞米松乳膏取10g加十四烷酸异丙酯20ml分散均匀，

50、加稀释剂100ml充分振摇，静止至分层，取下层水层部分作为供试液 簿膜过滤法,冲洗800ml簿膜过滤法,冲洗800ml簿膜过滤法,冲洗800ml3复方丹参片取10g，加100ml稀释液，电动匀浆2000r/min、2分钟簿膜过滤法,冲洗400ml常规法簿膜过滤法,冲洗400ml4清开灵片取10g，加100ml稀释液，电动匀浆2000r/min、2分钟簿膜过滤法,冲洗400ml常规法常规法5银杏叶片取10g，加100ml稀释液，电动匀浆2000r/min、2分钟簿膜过滤法,冲洗300ml常规法胆盐乳糖增菌液采用500 ml稀释培养；乳糖发酵采用40ml稀释培养6消糖灵胶囊取10g，加100ml稀