核酸疫苗.ppt

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1、核酸疫苗核酸疫苗LOGODiagram4 4核酸疫苗定义核酸疫苗定义1 12 23 35 5核酸疫苗的发展简史核酸疫苗的发展简史核酸疫苗的作用原理核酸疫苗的作用原理核酸疫苗的构建核酸疫苗的构建核酸疫苗的优缺点和应用现状核酸疫苗的优缺点和应用现状Company Logo 疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。人们将多种灭活或减毒疫苗称为第一代疫苗。将用基因工程的方法研制的亚单位疫苗称为第二代疫苗。理想疫苗应具备的特征有：安全、廉价、热稳定性好，含有多种具有保护作用的免疫原，最好是一次口服即可生效。目

2、前前两代均不能满足上述标准。故基因疫苗应运而生。基因疫苗被称为第三代疫苗。Company Logov1990年wolff等从事于基因治疗工作时，用外源性重组质粒给小鼠肌肉注射后，质粒被摄取并能在体内至少两个月稳定地表达所编码蛋白。v1991年Williams等发现外源基因输入体内的表达产物可诱导产生免疫应答。v1992年Tang等将表达人生长激素的基因质粒DNA导入小鼠皮内，小鼠产生特异性抗体，从而提出了基因免疫的概念。v1993年Ulmer等将注射技术用于研究流感核酸疫苗，证实核酸注射不但能在体内表达抗原蛋白，还可以诱导具有显著保护作用的免疫应答。v因此，1994年在日内瓦召开的专题会议上将

3、这种疫苗定名为核酸疫苗。Company Logo关于核酸免疫的国际会议v1994年5月17-18日，瑞士日内瓦。WHO主办。主题：核酸疫苗。v1995年2月16-17日，美国马里兰州，Bethesda（NIH）。主题：基因疫苗和核酸疫苗战略。v1995年4月6-9日，美国弗吉尼亚州。主题：DNA疫苗：疫苗学的新时代。v1996年2月5-8日，美国马里兰州NIH Natcher会议中心。主题：核酸疫苗预防传染性疾病和控制核酸疫苗。Company Logo定义 核酸疫苗(nucleic acid vaccine),也称基因疫苗(genetic vaccine),是指一类将抗原基因重组到表达载体上的

4、重组质粒疫苗，经肌肉注射或黏膜免疫等方法导入宿主体内，通过宿主细胞表达抗原蛋白，诱导宿主细胞产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。Company LCompany Logo基因疫苗的构建基因疫苗构建的基本途径Company Logo基因疫苗的构建一、构建基因疫苗的载体载体是将抗原基因导入到机体细胞的必要工具。1.载体的分类按照载体功能可分为克隆载体和表达载体；按照载体来源可分为质粒、噬菌体、黏粒和病毒载体等。2.常用于构建基因疫苗的载体pcDNA3.1、pcDNA3.1-E、pcDNA3.1/Zeo（+/-）、pcDNA4、pcDNA4/HisMAX、pBudCE4、pRc/

5、RSV、pRc/CMV2等多种 Company Logo基因疫苗的构建二、基因疫苗的构建方法1.抗原基因和载体的制备 获得需要的目的基因常用的方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库(genomic DNA library)，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。（4）化学合成Company Logo基因疫苗的构建基因表达载体的基因表达载体的组成：组成：复制原点复制原点+启动子启动子+目的基因目的基因+终止子终止子+标记基因标记基因 为了保证抗原基因的

6、定向正确插入，只有以正确的方向插入表达载体读框启动子下游才能表达抗原基因，故抗原基因两端应具有不同的酶切位点，在设计时须注意这点。Company Logo2.抗原基因与载体的连接 连接的方式可分为粘性末端连接和平末端连接两种，其中前者连接效率较高，使用比较多。连接反应时应考虑反应体积、抗原基因与载体的比例、温度和时间和酶量。Company Logo粘性末端连接用同一种或两种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因本法适用于在质粒和目的基因上有相同单或双酶切位点Company Logo平末端连接 质粒产生平末端的内切酶DNA连接酶产生粘性末端的内切酶核酸酶S1目的基因重组质粒产生粘性末端

7、的内切酶核酸酶S1本法适用于在质粒和目的基因上没有没有相同相同的酶切位点！Company Logo基因疫苗的构建3.重组质粒转化受体菌 转化：将质粒或者以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转染：将质粒或者以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。感受态：细菌经过CaCl2溶液处理和短暂热激后，容易摄入外源DNA，这种状态称为感受态。其原理是细菌处于0、低渗CaCl2溶液中时，细胞壁和细胞膜通透性增加。此时转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经短暂的热激（42 ）处理后，外源基因容易进入细菌细胞内。常用的方法为氯化钙共沉淀法和电穿孔法。Company Log

8、o基因疫苗的构建4.重组质粒的筛选与鉴定 一般重组质粒鉴定主要按照表型筛选、酶切鉴定和测序鉴定的顺序进行（1）插入片段鉴定：酶切鉴定；PCR鉴定。（2）插入片段方向性鉴定：可利用联合酶切方案进行目的基因的插入方向鉴定。（3）DNA序列测定：末端终止法测序；自动测序仪测序Company Logo基因疫苗的构建三、重组质粒在真核细胞中的表达与检测1.重组质粒导入真核细胞的方法 磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、脂质体介导等方法都可以用来将外源质粒导入真核细胞，其中脂质体介导容易成功，是最常用的方法。2.抗原基因在真核细胞中表达的检测（1）蛋白水平的检测：免疫沉淀法检测表达蛋白；Western印迹检测；酶联

9、免疫吸附测定。（2）核酸水平的检测：RNA印迹；RT-PCR检测。Company Logo 由于这个过程实际上是相当复杂的，所以人们对一些具体的细节并不清楚。下面通过对基因疫苗经过肌肉组织和黏膜免疫的抗原呈递途径来说明基因疫苗的工作原理。Company LCompany Logo基因疫苗经黏膜和皮肤组织免疫的抗原呈递 皮肤或者黏膜是具有高水平免疫监视系统的组织，黏膜淋巴组织的功能：参与粘膜局部免疫应答和产生分泌型IgA。而且在免疫动物时比较方便，尤其是大面积预防时，所以关于基因疫苗通过皮肤或黏膜免疫激活机体免疫反应机制的研究也比较活跃。基因疫苗经过黏膜和皮肤组织免疫可以分为直接免疫机体和重组减

10、毒胞内菌系统免疫两种形式。Company Logo（1）直接免疫 旅美中国科学家范泓然用皮肤涂抹法给小鼠接种乙肝疫苗取得成功，且检测其效果可以和所用的肌肉注射相媲美。黏膜淋巴结提供了浆细胞抗体型转化与Th0细胞向Th2细胞定向分化的微环境。基因疫苗经过黏膜免疫可以很好地激活B细胞分泌IgA，同时启动Th2细胞功能，但其对细胞免疫（尤其是CTL细胞）活化不足，通过黏膜免疫获得的保护作用不如通过肌肉免疫获得的强烈。Company Logo（2）用重组减毒胞内菌系统 采用志贺氏菌、沙门氏菌或李斯特菌等重组减毒胞内菌系统，通过粘膜自然感染途径运送 DNA 疫苗是一类很好的方法。因为它们可以将基因疫苗直

11、接呈送给 APCs，所以这种方法运送效率高、免疫方法简单、免疫效果好，能同时激活粘膜免疫和全身免疫，并可获得对载体菌的免疫等优点。减毒沙门氏菌通过自然感染的方式高效地将基因疫苗直接运送给体内的抗原提呈细胞（APCs）如树突细胞（DCs）和巨噬细胞，在粘膜和全身淋巴组织诱发以 Th1 型应答为主的细胞免疫和体液免疫，APCs尤其是 DCs可能在其中起到了关键作用。Company Logo携带基因疫苗重组减毒沙门氏菌诱发机体免疫应答的机制 重组减毒沙门氏菌携带的基因疫苗激发机体的细胞免疫和重组减毒沙门氏菌携带的基因疫苗激发机体的细胞免疫和体液免疫的机制还不完全清楚体液免疫的机制还不完全清楚。可能途

12、径一：DCs 和巨噬细胞吞噬侵入肠粘膜屏障的重组沙门氏菌并被激活，活化的 DCs 和巨噬细胞迁移到脾脏等淋巴组织（DCs 具有很强的迁移能力，而巨噬细胞尚有一些疑问），载体菌在此裂解，基因疫苗进入胞液，然后进入细胞核，最后表达目的抗原。接着激活特异的 CTL，裂解表达抗原的 APCs，APCs 内的抗原被释放激活辅助 T 细胞和诱导抗体反应，激活细胞免疫和体液免疫。可能途径二：重组沙门氏菌引起吞噬它的 APCs 凋亡，凋亡产物（含有目的抗原/基因疫苗）被邻近的 APCs 吞噬。Company Logo核酸疫苗的优缺点核酸疫苗的优缺点优点：1 免疫保护力增强 2 制备简单，省时省力 3 同种异株

13、交叉保护 4 应用较安全 5 产生持久免疫应答 6 贮存、运输方便 7 可用于防治肿瘤缺点：1 质粒DNA可能诱导自身免疫反应 2 持续表达外源抗原可能产生一些不良后果 3 肌肉注射质粒后，仅有很少部分被肌细胞所摄取 4 影响核酸疫苗诱发机体免疫应答的因素很多 外源DNA注入体内后，可能整合到宿主基因组上，使宿主细胞抑癌基因失活或癌基因活化，使宿主细胞转化成癌细胞 Company Logo核酸疫苗的应用现状核酸疫苗的应用现状v有关质粒DNA疫苗在人类及动物产生预防和治疗作用的研究报道不断增加，应用范围也逐渐扩大。人们期望用核酸疫苗来征服诸如微生物感染性疾病、寄生虫病等顽症，并用于肿瘤、遗传病和

14、其他多种疾病的基因水平治疗，所以作了多方面的尝试。v病毒感染性疾病的核酸疫苗病毒感染性疾病的核酸疫苗v非病毒微生物感染性疾病的核酸疫苗非病毒微生物感染性疾病的核酸疫苗v寄生虫核酸疫苗寄生虫核酸疫苗v肿瘤核酸疫苗肿瘤核酸疫苗Company Logo发展前景 核酸疫苗的研究只是近十几年发展起来的一项新的生物技术，它已成为疫苗研究领域中的热点之一，特别是其研究方向与世界卫生组织儿童疫苗计划的长远目标（用一种疫苗预防多种疾病）相吻合。现在已获得了迅速的发展。它的研究具有深远意义，可用于细菌、病毒、寄生虫等多种疾病的防治，其多价、高效、廉价等优点使其潜在的应用价值不可估量。核酸疫苗可能对人类疾病的防治以及畜牧业的健康发展起到划时代的作用。Company Logo