6细胞核和线粒体的分离和观察.pptx

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1、细胞核与线粒体的分级别离细胞核与线粒体的分级别离 第一页，共二十页。1.初步了解细胞内各种成分的别离方法 2、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的别离方法 3、对别离得到的细胞核及线粒体进行活性鉴定。一、实验目的一、实验目的第二页，共二十页。细胞器别离根本步骤细胞器别离根本步骤二、实验原理二、实验原理细胞破碎细胞破碎别离、纯化别离、纯化细胞器鉴定细胞器鉴定第三页，共二十页。一细胞破碎的方法一细胞破碎的方法1.1.杆状玻璃匀浆器法杆状玻璃匀浆器法2.2.高速组织捣碎机法高速组织捣碎机法3.3.超声波处理法超声波处理法4.4.化学裂介法化学裂介法5.5.反复冻融法反复冻融法二、实验原理二、实验原理第四

2、页，共二十页。细胞破碎的本卷须知：细胞破碎的本卷须知：1 1、匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖水溶液、匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖水溶液0.25mol/L 0.25mol/L。它比较近细胞质的分散相，具有足够渗透压，防止。它比较近细胞质的分散相，具有足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小，在颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小，在pH7.2-7.4pH7.2-7.4的条件的条件下细胞器不易发生聚集。下细胞器不易发生聚集。2 2、尽可能在低温条件下进行，防止酶失活。、尽可能在低温条件下进行，防止酶失活。3 3、假设是采用低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中的时间要、假设是采用低渗方式破碎细胞，匀浆

3、物在低渗溶液中的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束不要超过越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束不要超过5 5分钟。否分钟。否那么匀浆物在低渗溶液中时间太长，导致细胞器破裂，溶酶体那么匀浆物在低渗溶液中时间太长，导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。酶泄漏，各种物质降解。第五页，共二十页。二别离纯化的方法二别离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心成为亚细胞组分别离过程中最广泛应用的技术成为亚细胞组分别离过程中最广泛应用的技术 离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降

4、系数或浮力密度的差异进行别离、浓缩和提纯的一种方数或浮力密度的差异进行别离、浓缩和提纯的一种方法法 主要包括差速离心、密度梯度离心等方法。主要包括差速离心、密度梯度离心等方法。二、实验原理二、实验原理第六页，共二十页。差速离心法根根据据颗颗粒粒大大小小和和密密度度的的不不同同存存在在的的沉沉降降速速度度差差异异，分分级级增增加加离离心心力力，从从试试样样中中依依次次别别离离出出不不同同组组分分的的方方法法。从从低低速速到到高高速速逐逐级级沉沉淀淀别别离离，一般用于别离沉降系数相差较大一般用于别离沉降系数相差较大10倍及以上的颗粒。倍及以上的颗粒。优优点点是是：操操作作简简单单，离离心心后后用用

5、倾倾倒倒法法即即可可将将上上清清液液与与沉沉淀淀分分开开，并可使用容量较大的角式转子。并可使用容量较大的角式转子。缺缺点点是是：别别离离效效果果差差，不不能能一一次次得得到到纯纯颗颗粒粒；须须经经反反复复悬悬浮浮和和离离心心加加以以纯纯化化。壁壁效效应应严严重重，特特别别是是当当颗颗粒粒很很大大或或浓浓度度很很高高时时，在在离离心心管管一一侧侧会会出出现现沉沉淀淀；颗颗粒粒被被挤挤压压，离离心心力力过过大大、离离心心时时间间过过长会使颗粒变形、聚集而失活。长会使颗粒变形、聚集而失活。第七页，共二十页。第八页，共二十页。密度梯度离心下次课讲第九页，共二十页。三细胞器的鉴定分析三细胞器的鉴定分析

6、分析分级别离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功分析分级别离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。能鉴定。细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和别离纯度的主要依据，如细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和别离纯度的主要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B B染料保持在染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被复原成氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被复原成无色。也可使用罗丹明无色。也可使用罗丹明123123或或MitoTrackerMitoTracker等

7、荧光探针标记法等等荧光探针标记法等细胞核：细胞核：DNADNA亚甲基蓝、甲苯胺蓝、亚甲基蓝、甲苯胺蓝、HoechstHoechst染料等染料等第十页，共二十页。方法和步骤方法和步骤一细胞核的别离提取一细胞核的别离提取 1、肝脏，剪成小块、肝脏，剪成小块(去除结缔组织去除结缔组织)尽快置于盛尽快置于盛有有0.9NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去外表的液体。用滤纸吸去外表的液体。2、称取肝组织、称取肝组织1 g，剪碎；用预冷的，剪碎；用预冷的0.25 molL蔗糖蔗糖-0.05molL Tris-HCI缓冲液，缓冲液，pH7.40.25moll蔗

8、糖蔗糖0.003moll氯化钙溶液洗涤数次。氯化钙溶液洗涤数次。第十一页，共二十页。3、按每克肝加、按每克肝加8ml-9ml预冷的预冷的0.25molL蔗糖蔗糖 0.05m/L Tris-HCI溶液，用高速组织匀浆器匀浆溶液，用高速组织匀浆器匀浆已完成已完成 4、取一定量匀浆液，在、取一定量匀浆液，在04冰浴中用玻冰浴中用玻璃匀浆器将肝再次匀浆匀浆器下端浸入盛有冰块璃匀浆器将肝再次匀浆匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨中，上下转动研磨因已事先匀浆，本步骤因已事先匀浆，本步骤研磨次数和时间可缩短研磨次数和

9、时间可缩短 5、肝匀浆用双层纱布过滤，滤液制一张涂片、肝匀浆用双层纱布过滤，滤液制一张涂片,自然自然枯燥枯燥.第十二页，共二十页。第十三页，共二十页。6 6、滤液以、滤液以2500rpm2500rpm，离心，离心1515分钟；分钟；(1)(1)缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待别离线粒体用；有冰块的烧杯中，待别离线粒体用；(2)(2)同时涂一张上清液片同时涂一张上清液片做好标记，自然枯燥；做好标记，自然枯燥；(3)(3)余下的沉淀物进行下一步骤。余下的沉淀物进行下一步骤。第十四页，共二十页。7 7、用、用6ml 6ml 蔗糖一蔗糖一T

10、ris-HCITris-HCI溶液悬浮沉淀物，溶液悬浮沉淀物，以以2500rpm2500rpm离心离心1515分钟弃上清，将残留液体分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片上，涂片，自然枯燥。，自然枯燥。8 8、将、将、涂片用涂片用l l甲苯胺兰或亚甲苯胺兰或亚甲基蓝染色后盖片即可观察。甲基蓝染色后盖片即可观察。第十五页，共二十页。二高速离心别离提取线粒体二高速离心别离提取线粒体1、将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯、将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以中取出，配平后，以17000g离心离心20分

11、钟，弃上清，分钟，弃上清，留取沉淀物。留取沉淀物。本实验用本实验用12000rpm,非冷冻离心非冷冻离心2、参加蔗糖、参加蔗糖-Tris-Hcl 1ml，用吸管吹打成悬液，以，用吸管吹打成悬液，以17000g离心离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，参加取沉淀物，参加0.1ml蔗糖蔗糖-Tris-Hcl氯化钙溶液混氯化钙溶液混匀成悬液匀成悬液(可用牙签可用牙签)。第十六页，共二十页。3、取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于、取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上干净载玻片上(分别分别标记标记、涂片涂片)，各，各滴一滴滴一滴1詹纳斯绿詹纳斯绿b染液染

12、染液染20分钟分钟,盖片盖片观察。观察。4、油镜观察。、油镜观察。第十七页，共二十页。本卷须知1、各步骤参加的溶液的量需根据离心管的大小自行调整。2、线粒体的染色必须先染色20分钟后盖盖片，以便充分氧化。3、本实验所有操作本应在低温下进行，但实验室的冷冻离心机损坏，用普通离心机离心，温度和转速都和实验步骤有差异。第十八页，共二十页。实验报告方法：按照实际的操作记录结果：描述5张涂片镜下情况讨论：1、实际情况和理论预期是否符合？为什么？2、本实验步骤有哪些可以改进的地方？第十九页，共二十页。内容总结细胞核与线粒体的分级别离。2、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的别离方法。从低速到高速逐级沉淀别离，一般用于别离沉降系数相差较大10倍及以上的颗粒。8、将、涂片用l甲苯胺兰或亚甲基蓝染色后盖片即可观察。1、各步骤参加的溶液的量需根据离心管的大小自行调整。2、线粒体的染色必须先染色20分钟后盖盖片，以便充分氧化。2、本实验步骤有哪些可以改进的地方第二十页，共二十页。