NY∕T 2960-2016 兔病毒性出血病病毒RT-PCR检测方法(农业).pdf

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1、ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 2960一2016兔病毒性出血病病毒RT-PCR，检测方法Detecting method for rabbit haemorrhagic disease virus by RT-PCR 2016-10-26发布2017-04-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T 2960-2016 目IJr:I 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口o本标准起草单位:中国动物卫生与流行病学中心、江苏省农业科学院兽医研究所、河南牧业经济学院。本标准主要起草人

2、:邵卫星、王芳、魏荣、胡波、徐耀辉、魏后军、孙映雪、李卫华。I NY/T 2960-2016 兔病毒性出血病病毒RT-PCR检测方法范围本标准规定了检测兔病毒性出血病病毒RT-PCR检测方法的技术要求。本标准适用于检测疑似兔病毒性出血届.ri.温民EE器及鼻腔分泌物的兔病毒性出血病病毒核酸。2 缩暗语下列缩略语适用EB:、漠化乙链(Oligo d(T)l RHD:RNA:RT-Taq酶:TBE:T bp:碱基dNTPs:3 3.1 3.2 3.3 核酸电泳3.4 恒温水浴锅3.5 20C80C冰3.6 微量移液器(0.3.7 凝胶成像系统(3.8 生物安全柜。4 试剂4.1 AMV反转录酶或其

3、他反转录酶。4.2 RNA酶抑制剂。4.3 Taq DNA聚合酶。4.4 dNTPs。4.5 TRIZOL RNA提取试剂。4.6 1.0%琼脂糖凝胶，见A.l。4.7 5X TBE缓冲液，见A.2。4.8 DNA染料:澳化乙链(EB)。1 NY/T 2960-2016 警告:电泳中用到的EB可诱发基因突变，在操作中应戴手套和口罩。试验中被EB污染的物品要有专用收集处，并进行无害化处理。4.9 焦碳酸二乙醋(DEPC)水，见A.3。警告;DEPC对眼睛和呼吸道黯膜有强剌激，在操作中应在通风条件下进行。使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。4.10 异丙醇:一180C以下预冷。4.11

4、75%乙醇:一180C以下预冷。4.12 氯仿。警告:氯仿毒性属中等毒性，吸入或经皮肤吸收会引起人体不适及皮肤黯膜剌激症状，在操作中应在通风条件下进行。使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。4.13 DNA分子量标准(DL2000 DNA Marker)。4.14 6X电泳上样缓冲液。5寻|物5.1 反转录引物见B.1。5.2 PCR引物见B.2。6 操作程序6.1 样品的采集及处理过程的注意事项采样过程中样本不得交叉污染，采样、样品处理及RNA提取过程中应戴一次性手套和口罩。6.2 样品的采集及处理6.2.1 肝脏等脏器的采集和处理无菌取疑似RHD死亡兔肝脏等脏器5g，分别剪碎作为检

5、测样品。同时，以RHD死亡兔和正常兔肝脏等脏器分别作为阳性和阴性对照样品，同样处理。一180C以下冰箱可保存1个月。运输过程中需加冰袋保存。6.2.2 鼻腔分泌物的采集和处理用DEPC水润湿棉签拭子，深入兔鼻腔内部涂抹数次，然后放到含0.2mL DEPC水的EP管中。-180C以下冰箱可保存1个月。运输过程中需加冰袋保存。6.3 RNA的提取6.3.1 TRIZOL 法实验室没有商品化RNA提取试剂盒采用此方法。将5倍样品量的DEPC7.K加人脏器组织中，研磨成悬液，装人DEPC处理过的EP管中，一180C以下反复冻融3次，5000g离心5min，取200L上清液作为待提取样品(浸泡于EP管中

6、的棉签拭子，经反复挤压5次后，5000 g离心5min，取200L上清液作为待提取样品)。然后，加入700LTRIZOL,振荡混匀后，室温放置10mi口，加人氯仿300L。振荡?昆匀后，室温放置30min,40C 10000 g离心15mlno取上层水相600L，加人等体积的异丙醇，混匀，一180C以下放置2h以上或过夜，40C10000 g离心15min，去上清液，缓缓加入75%乙醇1mL洗涤，40C5000 g离心5min，去上清液，室温干燥20mln，加入DEPC水10L，使充分溶解。6.3.2 试剂盒法实验室有商品化RNA提取试剂盒采用此方法。6.4 反转录(RT)6.4.1 RT反应

7、体系RNA dNTPs(10 mmol/L)RNA酶抑制剂(RNaseInhibitor)(40U/L)AMV反转录酶(5U/L)5XAMV反应缓冲液Oligo d(T)18(反转录引物)总体积(Total)6.4.2 RT反应程序5.75L 1.0 L O.25L O.5L 2.0 L O.5L 10.0 L NY/T 2960-2016 300C 10 min,420C 30 min,990C 5 min，取出，可以直接作为模板进行PCR，或者放于180C以下保存备用。试验中同时设立阳性对照和阴性对照。6.5 PCR 6.5.1 PCR反应体系MgClz(25 mmol/L)1.5L 反转

8、录产物4.0 L 10XTaq DNA聚合酶反应缓冲液2.5L dNTPs(10 mmol/L)O.5L 上游引物(50pmol/L)O.5L 下游引物(50pmol/L)O.5L Taq DNA聚合酶C5U/L)O.5L 灭菌去离子水15.0 L 总体积CTotal)25.0 L 6.5.2 PCR反应程序940C 5 min;940C 30s,56.80C 30s,720C 45s，25个循环;720C延伸10min，结束反应。6.6 扩增产物的电泳检测6.6.1 制备1.0%琼脂糖凝胶板，见A.1。6.6.2 取10.0LPCR产物与2.Of.LL 6X上样缓冲液濡合，加人琼脂糖凝胶板的

9、加样孔中，同时加人DNA分子量标准。6.6.3 盖好电泳仪，插好电极，5V/cm恒压下电泳30mino 6.6.4 用紫外凝胶成像系统在302nm波长的紫外下观察，并对图片拍照、存档。6.6.5 用分子量标准比较判断PCR片段大小。7 结果判定7.1 试验结果成立条件阳性对照的扩增产物经电泳检测，在约591bp位置出现特异性条带，阴性对照的扩增产物经电泳检测均未出现约591怜的特异性条带。阴、阳性对照同时成立则表明试验有效，否则试验无效。7.2 阳性判定在试验结果成立的前提下，如果被检测样品的PCR产物电泳后在约591怜的位置上出现特异性条带，判定为该样品兔病毒性出血病病毒核酸阳性，如需要进一

10、步确认，可进行测序分析(序列参见附录。;若条带极弱，难以判定，需重新做一次试验，在约591怜的位置出现特异性条带，可判定为该样品兔病毒性出血病病毒核酸阳性，如需要进一步确认，可进行测序分析(序列参见附录C)，若目的条带仍然极弱，可判定为该样品兔病毒性出血病病毒核酸可疑，需用其他方法检测。3 NY/T 2960-2016 7.3 阴性判定在试验结果成立的前提下，在约591bp位置未出现特异性条带，可判定为该样品兔病毒性出血病病毒核酸阴性。8 案例检测10份家兔肝脏样品的操作术式参见附录D。4 A.1 1.0%琼脂糖凝胶琼脂糖O.5 XTBE 微波炉中完后取下梳子，备倒人电泳A.3 附录A(规范性

11、附录)试剂的配制NY/T 2960-2016(EB溶液15L，摇匀，b NY/T 2960-2016 B.1 反转录引物见表B.l。引物名称Oligo d(T)18 附录B(规范性附录)引物表B.l反转录引物引物浓度50 pmol/L B.2 PCR引物(参考株为中国CD株，GenBank登录号:AY523410j见表B.20 表B.2PCR引物引物名称引物浓度引物序列(53)上游引物P150 pmol/L 5-cgt gct tca gtt ttg gta-3 下游引物P250 pmol/L 5-atg agt gct gac gag tag-3 6 寻|物序列(53)ttttt tl t

12、tl tl tl tttt 片段长度591 bp GenBank NO:AY523410 附录C(资料性附录)测序分析参考序列NY/T 2960-2016 cgtgcttcagttttggtacgctaatgctgggtctgcaattgacaaccctatttcccaggttgcaccggatggcttccctgacatgtcattcgtgccctttaacagcccc aacattccaaccgcggggtgggtcgggtttggtggtatttggaacagtaacaacggtgcccctgctgccacgaccgtgcaggcctatgagttaggttttgccact ggggca

13、ccaaataacctccagcccaccaccaacacttcaggtgcacagactgtcgccaagtccatttatgccgtggtaaccggcacaaaccaaaatccaaccg gactgtttgtgatggcctcgggtattatctccaccccaagcgccagcgccgtcacatacacaccccaaccagacagaattgtgactacacccggcactcctgccg ctgcacctgtgggtaagaacacacccatcatgttcgcgtctgttgtcaggcgcaccggtgacgtcaacgtcgcagctgggtcaaccagcgggaccc

14、agtacgg cacgggctcccaaccactgccagtaacaattggactttcgctcaacaactactcgtcagcactcat 7 NY/T 2960-2016 附录D(资料性附录)案例:检测10份家兔肝脏样品的操作术式D.1 元菌取10份待检肝脏各5g,RHO 加入各份肝脏组织中。研磨离心5min。取200L上D.2 每份样品加人700温放置3Om口1mD.3 40C 10000 g 上或过夜。19.5L 下游引物、6.5 积的PCR管中，25L。D.8 按本标准7.D.9 12份样品分别中，同时加入ONAD.10 盖好电泳仪，插好电D.11 用紫外凝胶成像系统在D.12 D.13 兔出血病病毒RT-PCR检测阴阳性产物参照图(见图0.1)。8 各5g，分别将25mL的OEPC7j(180C以下反复冻融3次，5000g 300L，振荡混匀后，室以下放置2h以。具体为:取液、6.5L，每支4.25 具体为:取|物、6.5L 支200L体每管总体积为591 bp一说IYl:M一-D八分子量标准(DL2000 Marker);l一一RHDV肝脏阳性对照;2一一一阴性肝脏对照。2 M-2 000 bp 一1000bp 750 bp-500bp-250 bp 一100bp 图D.l兔出血病病毒RT-PCR检测阴阳性产物参照图NY/T 2960-2016 9