SC∕T 7233-2020 急性肝胰腺坏死病诊断规程(水产).pdf

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1、ICS 65.020.30 B 41:才叫中华人民共和国水产行业标准SC/T 7233一2020急性肝膜腺坏死病诊断规程Code of diagnosis for acute hepatopancreatic necrosis disease 2020-08-26发布2021-01-01实施气缸中华人民共和国农业农村部发布SC/T 7233-2020 I SC/T 7233-2020 急性肝腰腺坏死病诊断规程1 范围本标准给出了急性肝膜腺坏死病诊断(acutehepatopancreatic necrosis disease,AHPND)的术语和定义、缩略语、试剂和材料、器材和设备、临床症状，

2、规定了采样、组织病理学检测、分子生物学检测、菌种鉴定和综合判定。本标准适用于致急性肝V户AHPND)引起的对虾急3 4 SPF:元特定病原体(specificTaq酶水生栖热菌DNA聚合酶(Therm古m帽sDNApolymerase)VAHPi咽:致急性肝膜腺坏死病弧菌(AHPND-causingVibrio spp.)5 试剂和材料5.1 除非另有说明，标准中使用的水为蒸饱水、去离子水或相当纯度的水。5.2 二甲苯:分析纯。5 3 中性树胶。5.4 DAFA固定液:见附录A中的A.l.5.5 苏木精染色液.见A.205.6 1%伊红储存液:见A.30SC/T 7233-2020 5.7 1

3、%焰红储存液:见A.4。5 8伊红-焰红染色液:见A.505 9粘片JliJ:见A.6。5.10 95%乙醇-分析纯5.11 85%乙醇.见A.7。5.12 80%乙醇:见A.805.13 75%乙醇见A.9。5.14 70%乙醇:见A.1005.15 50%乙醇:见A.11o5 16 组织病理学检测阳性对照为受V户AHPD感染且显示明显病理变化的对虾肝膜腺组织切片。5.17 组织病理学检测阴性对照为未受VpAHIND感染的健康对虾肝膝腺组织切片。5.18 dNTPs(各2.5mmol/U，含dATP、dTTP，dGTP、dCTP各2.5mmol/L的混合物，一20.C保存。5.19 10XP

4、CR缓冲液，无MgZ-20.C保存.5.20 MgClz(25 mmol/U，一20.C保存。5.21 T，叫酶(5U/L)，一20.C保存。5.22 分子生物学检测阳性对照为已知受V户AHJND感染的对虾肝膜腺组织、DNA，或VAJ-IIND菌液DNA，或含有户irA叩、户irB叩基因的质粒DNA，-20.C以下保存。523 分子生物学检测阴性对照为SPF对虾组织DNA，-20.C以下保存。5.24 分子生物学检测空白对照为灭菌双蒸水.5.25 50X电泳缓冲液见A.12.5.26 1X电泳缓冲液.见A.13.5.27 6X载样缓冲液。528 琼脂粉。5.29 DNA分子盘标准。5 30 琼

5、脂糖凝胶电泳核酸染料及其他等效产品。6 器材和设备6 1 切片机。6 2 组织脱水机。6 3 包埋机。6.4 染色机。6 5 展片水浴锅.6.6 平板烘片机.6.7 显微镜。6.8 PCR仪。6.9 电泳仪。6 10 水平电泳梢。6.11 紫外观察仪或凝胶成像仪。6.12 荧光定盘PCR仪。6 13 高速离心机。2 6.14 微量移液器。7 临床症状SC/T 7233-2020 患病对虾甲壳发软，空肠空胃或肠道内食物不连续，肝胶腺色浅发白，萎缩变小，表面常见黑色斑点和条纹，不易用手指捏破。参见附录BoB 采样8.1 采样对象凡纳滨对虾(Litopenaeusval1llamei)和斑节对虾CP

6、enaeusmOl1odon)等易感品种，优先选择濒死虾或具有临床症状的对虾。参见附录Bo8.2 采样数量、方法和保存运输应符合GB/T28630.4-2012中附录B的要求。8.3 样品采集8.3.1 组织病理学检测的样本，选取肝腋j尿，快速浸入DAFA固定液中固定.24h后换人70%乙醇中长期保存。8.3.2 分子生物学检测的组织样本，选取肝腕腺、胃、中肠及后肠。亲虾的非致死检测取粪便。所取样品立即进行DNA提取，或暂存于95%乙酶中，或保存于200C。采样时，稍大的虾取个体检测，仔虾或未达到0.5g的样品可合并样本。8.3.3 对于细菌分离的样品，用无菌牙签从肝膜腺或胃部部取微量液体，按

7、GB4789.7进行分离和增菌培养。9 组织病理学检测l9 1 操作方式使用6.1-6.6中设备或手动操作完成。9.2 修块样品切片前的取材修整，应符合GB/T28630.4-2012中附录B的要求，保证病灶部位能被有效地切片。9 3 脱水75%乙蹲(1h 45 min)85%乙醇(1h 45 min)85%乙醇(1h 45 min)95%乙酶(45min)95%乙醇(45min)无水乙醇(45min)无水乙醇(45min)。9.4 透明无水乙E事:二甲苯(1,1)(25 min)二甲苯(20min)二甲苯(20min)。9.5 浸蜡纯石蜡(1h 20 min)纯石蜡(1h 20 min)。9

8、.6 包埋9 7切片厚度5m。对每个石蜡包埋块至少切取2片不连续的切片。9.8 展片宜400C展片，用涂有一层粘片剂的载玻片捞出，置于平板烘片机上于450C烘片2人9.9 染色二甲苯(5min)二甲苯(5min)无水乙酶(2min)无水乙醇(2min)95%乙醇(2min)95%乙醇(2min)80%乙蹲(2min)80%乙醇(2min)50%乙酶(2min)蒸馆水(2min)蒸馆水(2 min)蒸馆水(2min)苏木精染色液(5min)缓慢流动的自来水(6min)伊红-焰红染色液SC/T 7233-2020(2 min)95%乙醇clmin 20s)95%乙醇(2min)无水乙醇(2min)

9、元水乙醇(2min)二甲苯(2 min 30 s)二甲苯(2min 30 s)二甲苯(2min 30 s)。9.10 封片滴加2商中性树胶封片。9.11 观察显微镜下观察。9.12 病理诊断急性感染期，可见虾肝肢腺小管细胞困化和脱落，细胞脱落量的继发性细菌感染，与坏死病组织病理学图例，10.1 DNA提取10.1 1 5 min 10.3.1 MgCl2(25 00mol/L)0.5 7JC 15.2L。扩增基因irA叩、rB叩10 3.2 第一步PCR反应程序渐进性变性，部分细胞核膨大，伴随明显的上皮，可见明显的小管间血细胞浸润和大V户AHPiD感染。急性肝膜腺的样品DNA，同Mg2+)2.

10、5L、L、引物AP4-R1L)lL、灭菌双蒸产物片段大小1 269 bp 230 bp 将上述PCR管置于PCR仪中，按以下反应程序进行扩增940C2 min;94C 30 s、550C30 s、720C1 min 30 s，30个循环;720C延伸2min片OC保温。10.3.3 第二步PCR体系配制按照表1中引物序列配制第二步PCR反应体系，分装i1JPCR管中。25LPCR反应体系，包括lOXPCR缓冲液(无Mg+)2.5L、MgCl，(25 mmol/Ll 3L、dNTPs(各2.5 mmol/Ll 2L、引物AP4-F200mol/L)O.375L、引物AP4-R2ClOmol/L)

11、0.375L、Taq酶(5U/L)0.3L、模板DNA(第一步PCR反应产物)1L、灭菌双蒸水15.45L，SC/T 7233-2020 10.3.4 第二步PCR反应程序将上述PCR管置于PCR仪中，按以下反应程序进行扩增，94C2 min;94C 20 5,55C 205、72C20 5,25个循环;72C延伸2min;4C保温。10.3.5 琼脂糖凝股电泳及测序10 3.5 1 配制1.5%的琼脂糖凝胶，按比例1m入电泳核酸染料。103.5.2 将5LPCR反应产物与1L6X载样缓冲液(宜含电泳核酸染料混匀后加入到加样孔中。同时，设立DNA分子虽标准对照。10.3.5.3 在1V/cm-

12、5 V/cm的电压下电泳，使DNA由负极向正极移动。当载样缓冲液中澳西班蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的1/2-2/3处时停止电泳，将凝胶置于紫外观察仪或凝庭成像仪下观察或拍!在.10 3.5 4 如果观察到预期大小条带，对PCR扩增产物进行现tl序。10.3.6 结果判定10.3.6.1 DNA提取质量监控成立时，阳性对!l第一步PCR后在1269 bp和/或第二步PCR后在230bp 处有特定条带，阴性对照在1269 bp和230bp处均无条带且空白对照不出现任何条带，实验有效。103.6.2检测样品第一步PCR后在1269 bp处有条带和/或第二步PCR后在230bp处有条带，且PCR产

13、物测序结果符合参考序列(参见附录0)，判为VAHIl咽套式PCR结果阳性;检测样品第一步PCR后在1269 bp处无条带且第二步PCR后在230bp处无条带，判为VAHPND套式PCR结果阴性。10.4 qPCR检测10.4.1 qPCR反应体系配制按照表2中引物和探针配制qPCR反应体系，分装到PCR管中。分别加入各样品筷板DNA，同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照。25LPCR反应体系，包括2X PCR Premix(Probe qPCR)l2.5L、引物VpPirA-FOOmo1/UO.75L、引物VpPirA-ROOmo1/UO.75L、TaqmanProbeOOmol/U 0.25

14、L、模板DNA(浓度为50ng/L-lOO ng/UlL、灭菌双蒸水9.75L.qPCR反应体系配ilJtJ可采用同等效果的商品化探针法qPCR试剂盒。扩增基因irA、p10.4.2 qPCR反应程序表2qPCR检测引物和探针引物和探针名称VpPirA-F VpPirA-R Taqman Probe 引物和l探针序列(5-3)TTGGACTGTCGAACCAAACG GCACCCCATTGGTATTGAATG 6F AM-AGACAGCAAACATACACCTATCATCCCGGA-T AMRA 将上述PCR管置于荧光定盘PCR仪中.按以下反应程序进行扩增，95C20 5;95C 3 5、60

15、C30 5,45个循环，在每个循环结束后收集荧光信号。10.4.3 结果判定10.4.3.1 DNA提取质量监控成立时，阴性对照和空白对照应无Ct值，阳性对!lCt值35，旦出现S形典型扩增曲线，实验有效。10.4.3.2 检测样品Ct值35旦出现典型扩增曲线，判定为VAHlN D qPCR结果阳性;检测样品无扩增曲线，或Ct值;40，判定为VAHlNDqPCR结果阴性。104.3.3 对于35Ct值冰醋酸过滤海水混匀，室温水(50苏木萦腆酸销例明矶拧核酸水合焰红B(水溶性)水溶解后置于棕色瓶中A5 伊红-焰红染色液1%伊红储存液1%焰红储存液95%乙醇冰醋酸?昆匀后即可使用，室温储存。A6

16、粘片ffiJ明胶热水溶解后，加入:附录A(规范性附录)试剂配方100 mL 10 mL 780 mL 4 mL 1 g 100 mL SC/T 7233-2020 7 SC/T 7233-2020 苯盼2 g 甘i由15 mL 混匀，在棕色瓶中室温储存。A 7 85%乙醇95%乙鄙850 mL 力H水定容至950 mL 混匀，室温储存。A.8 80%乙醇95%乙醉800 mL 1m水定容至950 mL 混匀，室温储存。A.9 75%乙醇95%乙醇750 mL 1m水定容至950 mL?昆匀，室温储存。A.10 70%z;醇95%乙醇700 mL 1JD水定容至950 mL 混匀，室温储存。A.

17、11 50%乙醇95%乙醇500 mL 加水定容至950 mL 混匀，室温储存。A.1250X电泳缓冲液Tris 242 g 冰乙酸57.1 mL 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)100 mL 1Jn水定容至1000 mL 室温储存。A 13 1 x电泳缓冲液50X电泳缓冲液20 mL 加水定容至1000 mL 室温储存.8 B1 急性肝腕腺坏死病的发生与流行附录B(资料性附录)急性肝膝眼坏死病SC;T 7233-2020 急性肝腋腺坏死病(Acutehepatopancreatic necrosis disease,AHPND)是由副浴血性弧菌(Vibrioparahaemoly

18、ticus)的特定毒力株(VpAHIND)引起的对虾细菌性疫病。其他已报道可引起该病的弧菌种类包括哈维氏弧菌(V.harueyi)、欧文斯氏弧菌(V.owellsii)、坎贝氏弧菌(V.campbellii)0 通常，在养殖池放苗(仔虾或幼虾)后的7 d35 d内突发大规模死亡(高达100%)。患病后的对虾表现出甲壳发软，体色变浅，尾扇或附肢发蓝，空肠空胃或肠道内食物不连续.发病初期，肝膜腺白膜消失，色浅发白，萎缩可达50%以上且不易用手指捏破，晚期表团常可见黑色斑点和条纹，见图B.10显微镜下观察散开的肝膜腺小管，可见由于小管璧肌丝圈异常收缩而导致小管形态上出现分节的秽J痕。因1 1白床症状

19、及死亡最早始于放苗后l周左右，该病曾被称为早期死亡综合征(Earlymortality syn-drome,EMS)0发病虾通常死于池底，也曾称作偷死病快速发病的虾会出现跳出水面后沉底死亡的现象，又称跳跳死(Lastjump)0 2010年，AHPND首次发现于中国和越南境内，随后马来西亚、泰国、墨西哥和菲律宾等地相继出现，造成巨额经济损失。)让l俯对虾11白床表现b)血病对虾解剖后肝且Ii腺注(左1、在2)忠平:HPND的凡纳出对虾f，)J虾，注。(左)发白、表面可见黑色斑点，(右I)正常对虾。(右)血病初期，白眼消失。图B.lAHPND患病对虾临床表现Vp AHPND已通过浸浴、投喂(经口

20、)、反向激肠和共居等模拟自然水平传播方式实现了人工感染。有证据表明，在AHPND流行的养殖对虾中流行率可达到近100%0低盐度(6)的水源似乎能减少疫病的发生。4月7月干热的季节是发病高峰时期。过多投H臣、劣质苗种、底质或水质恶化、劣质饲料、藻华暴发或倒藻也是导致AHPND在流行区域发生的诱因。实验研究显示，VpAHPI咽不能由冰冻过的受感染对虾传播。B.2 病原和病理学特征AHPND由副浴血性弧菌的特定毒力株cv.户AHIND)引起，该毒株携带一个约70kbp的质粒，可编码与杀昆虫发光杆菌毒素同源(Pirtoxin)的PirA和PirB双亚基复合毒素。V户AHPND中的该质粒被称为pVA1同

21、源质粒，其大小可能有少许差异。去除pVA1能使V户AHPiO株失去致AHPND能力。在VpAH阳。菌群中，个别细菌能发生Pir霉素基因Pi严的自然删除。该删除是因为Pir毒素基因PirTJ两侧重复序列或转座酶的不稳定性所致。当删除发生时，意眯着V户AHPND株将失去诱发AHPND的能力。质粒9 SC/T 7233-2020 pVAl也携带一个接合转移相关的基因簇，意味着该质位具有转移到其他细菌的潜在能力。AHPND引起的组织病理学变化仅限于对虾消化系统的肝膜腺。正常肝膝腺小管末端封闭，E细胞数盘众多，排列紧密，偶见分裂相，细胞质嗜酸和嗜碱性混合着色;小管中段到基部可见B、F和R细胞分布，前段有

22、细胞质强嗜碱做着色的F细胞和较小脂滴的R细胞;中段F细胞数量逐渐减少，出现细胞内有较大分泌泡的B细胞，R细胞内脂滴增多;后端R细胞脂滴变的较大而数量丰富，B细胞分泌泡很大并向管腔分泌，基部多个小管融合，管腔增大并通向后胃。AHPND分为急性期和末期两个明显的病理特征阶段。模拟自然的浸浴感染表明，感染后2d9 d，对虾的肝膝腺、自思、肠道、肌肉组织均能检测到Pi严，最早的高峰出现在鲸中，肝腋腺在感染后第4 d达到高峰，随后肌肉、肠道分别在第4d5 d达到高峰。早期感染剑、组织中。在高死亡发生期，V;户AHP:O主要分布在肝膜腺和肠道，在死亡数量逐渐下降的后期，各组织中的V户AHPiI)均快速下降

23、，肠道、肝膜腺和肌肉中的V户AHPID水平趋于接近。B.3 宿主易感宿主种类包括凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、斑节对虾(Pella阳.monodon)。非完全确认易感性的宿主种类有中国明对虾(Fennero户enae削chinensis)。另外，有报道在日本续对虾(MarsupenaeUS J户onicus)、三17梭子IfffCPortun旧tr山berculatus)的PCR检测结果出现阳性，但其易感性尚未明确。10 SC;T 7233-2020 附录C(资料性附录)急性肝膜腺坏死病组织病理学图例V户AHPND感染凡纳滨对虾的组织病理变化见图C.1 0 注1图(A)

24、为H-E染色.标尺:50m.急性期，无B细胞、F细胞和R细胞.肝腕腺小臂上皮细胞脱落.注2图()为H-E染色，标尺100m。末期的早期阶段，坏死并脱落的肝脚跟小管上皮细胞(NC)和被血细胞浸润包围的肝脱脱小管残余.注3图(C)为H-E染色，标尺50m.末期，肝腕腺小管管腔可见脱落细胞箭头)且伴随着明显的细菌定槌(C)且被血细胞湿润包围的肝脱脱、管残余.注4图(0)为H-E染色.标尺30m.受影响的小管元B细胞、F细胞和IR细胞，肝脱脱小管上皮细胞的部分细胞核膨大(箭头)图C.1 V P AHII1感染凡纳滨对虾的组织病理变化11 SC/T 7233-2020 附录D(资料性附录)致急性肝腕腺坏

25、死病副溶血性弧菌(VPMII1)l分子生物学检测l产物序列ATGAGTAACA ATATAAAACA TGAAACTGAC TATTC TCACG ATTGGACTGT CGAACCAAAC 61 GGAGGCGTCA CAGAAGTAGA CAGCAAACAT ACACCTATCA TCCCGGAAGT CGGTCGTAGT 121 GTAGACATTG AGAATACGGG ACGTGGGGAG CTTACCATTC AATACCAATG GGGTGCGCCA 181 TTTAl、GGCTGGCGGCTGGAA AGTGGCTAAA TCACATGTGG TACAACGTGA TGAAAC

26、TTAC 241 CATTTACAAC GCCCTGATAA TGCATTCTAT CATCAGCGTA TTGTTGTAAT TAACAATGGC 301 GCTAGTCGTG GT门口GTACAATCTATTAC CACTAAGAAG GTGCTCACAT GACT AACGAA 361 TACGTTGTAA CAATG TCATC TTTGACGGAA TTTAACCCT A ACAATGCTCG TAAAAGTTAT 421 TTATTTGATA ACTATGAAGT TGATCCTAAC TATGCTTTCA AAGCAATGGT TTCATTTGGT 481 CTTTCAAATA

27、TTCCTTACGC GGGTGGTTTT TTATCAACGT TATGGAATAT CTTTTGGCCA 541 AATACGCCAA ATGAGCCAGA TATTGAAAAC ATTTGGGAAC AATTACGTGA CAGAATCCAA 601 GATTI、AGTAGA TGAATCGAT TATAGATGCC A TCAATGGAA TATTGGATAG CAAAATCAAA 661 GAGACACGCG ATAAAATTCA AGACATTAAT GAGACTATCG AAAACTTCGG T TATGCTGCG 721 GCAAAAGATG ATTACATTGG TTTAGT

28、TACT CATTACTTGA TTGGACTTGA AGAGAACTTT 781 AAGCGCGAGC TAGACGGTGA TGAATGGCTT GGTTATGCGA TATTGCCTCT ATT户GCAACA841 ACTGTAAGTC TTCAAATTAC TTACATGGCT TGTGGTCTGG ATTATAAGGA TGAATTCGGT 901 TTCACCGATT CTGATGTGCA TAAGCTAACA CGTAATATTG ATAAGCTTTA TGATGATGTA 961 TCGTCTTACA TTAC民GAACTCGCTGCGTGG GCTGATAACG ACTCTT

29、ACAA TAATGCAAAC 1021 CAAGATAACG TGTATGATGA AGTGATGGGT GCTCGTAGTT GGTGTACGGT TCACGGCTTT 1 081 GAACATATGC TTATTTGGCA AAAAATCAAA GAGTTGAAAA AAGTTGATGT GTTTGTTCAC 1 141 AGTAATTTAA TTTCATATTC ACCTGCTGTT GGTTTTCCTA GTGGTAATTT CAACTATATT 1 201 GCTAC乱GGTACGGAAGATGA AATACCTCAA CCATTAAAAC CAAATATGTT TGGGGAACG

30、T 1 261 CGAAATCGT 注。一一一(榄线加粗)为密式PCR引物序列夕阳仙，=二(双横线加粗)为套式PCR引物序列内侧);-一一气横钱灰底色)为荧光定结PCR引物序列，-(浊浪线灰底。为荧光定缸PCRTaqMan探针序列.12 ONON-gNh 同hvSC/T 7233-2020 中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(由i政编码100125 网址V)化学工业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销4峰奇峰奇峰 印张1.25 字数25千字2020年12月北京第1次印刷4峰2020年12月第1版书号同16109 8356 定价32.00元暗开本880mmX1230mm 1/16 版权专有侵权必究举报电话(010)59194261 SC/T