SN∕T 1439-2013 国境口岸埃博拉病毒分子生物学检测方法(出入境检验检疫).pdf

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1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 代替 国境口岸埃博拉病毒分子生物学检测方法犕 狅 犾 犲 犮 狌 犾 犪 狉犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犿 犲 狋 犺 狅 犱 狊狅 犳犈 犫 狅 犾 犪狏 犻 狉 狌 狊犪 狋 犳 狉 狅 狀 狋 犻 犲 狉狆 狅 狉 狋 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准代替 国境口岸埃博拉出血热病毒检验规程。本标准与 相比，主要技术变化如下：修改了标准的中英文名称；原标准提供的检测方法，如病毒分离培养、电子显微镜检查、间接免疫荧光试验、免疫印迹试验等都涉及活病毒，必须在 实验室内

2、才能进行，基本不具备可操作性，因此，本标准结合生物安全要求，将原标准中的方法全面进行了修改。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：黄吉城、李燕、师永霞、郑夔、李小波、洪烨、幸芦琴、相大鹏、郭波旋、钟玉清、莫秋华、史咏梅。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：。犛 犖犜 国境口岸埃博拉病毒分子生物学检测方法范围本标准规定了国境口岸埃博拉出血热疑似病例血清标本中埃博拉病毒检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理，苏丹埃博拉病毒和扎伊尔埃博拉病毒常规 检测和实时荧光 检测以

3、及埃博拉病毒基因芯片法等检测方法。本标准适用于国境口岸入出境人员埃博拉出血热疑似病例临床标本中的分子生物学检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。实验室生物安全通用要求术语和定义下列术语和定义适用于本文件。埃博拉出血热犈 犫 狅 犾 犪犺 犲 犿 狅 狉 狉 犺 犪 犵 犻 犮 犳 犲 狏 犲 狉；犈 犎 犉由埃博拉病毒（，）引起的一种急性出血性传染病。人主要通过接触病人或感染动物的体液、排泄物、分泌物等而感染，临床表现主要为发热、出血和多脏器损害。埃博拉出血

4、热的病死率高，可达 。本病于 世纪 年代在非洲首次发现，主要在非洲的乌干达、刚果、加蓬、苏丹、科特迪瓦、利比里亚、南非等国家流行。埃博拉病毒犈 犫 狅 犾 犪狏 犻 狉 狌 狊又称埃博拉出血热病毒，属丝状病毒科，为单股负链 病毒，是至今人类所知的最为恐怖的病毒之一，被世界卫生组织（）列为潜在的生物战剂病原体。可分为四种不同亚型：扎伊尔埃博拉（）、苏丹埃博拉（）、科特迪瓦埃博拉（）和莱斯顿埃博拉（）。前种亚型可使人和灵长类动物发病。缩略语下列缩略语适用于本文件。：反转录聚合酶链反应实时荧光 ：实时荧光反转录聚合酶链反应 值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数：核糖核酸：荧光染料

5、，一种荧光报告基团犛 犖犜 生物安全要求埃博拉出血热疑似病例血清标本中相关材料的生物安全要求按 执行，如：埃博拉病毒相关的感染性材料的操作应在生物安全三级（或 ）实验室内进行；埃博拉病毒相关的灭活材料的操作应在生物安全二级（）实验室内进行；埃博拉病毒的病毒培养物运输包装分类为类，编号为 。标本的采集、运输和保存无菌采集疑似病例发病周内静脉血 ，室温静置 使其凝固，犵离心 ，收集血清于无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温送到实验室检测。如 内不能送到实验室，将血清置于 保存。标本的处理血清标本直接进行分子生物学核酸的提取，如不能在 内检测应存放在 冰箱。分子生物学检测 犚 犜 犘

6、犆 犚法 主要仪器本方法使用的主要仪器如下：扩增仪；千分之一天平；超净工作台；级生物安全柜；高压灭菌锅；低温高速离心机：最大离心力 犵；电泳仪；凝胶成像分析系统；旋涡振荡器；冰箱：、和；移液器：、和；恒温水浴锅。主要试剂除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。本方法使用的主要试剂如下：核酸提取试剂：用德国 公司 ）提取病毒核酸；）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。犛 犖犜 试剂：德国 公司 ）；处理的无 酶的水；电泳缓冲液（）：称取 碱，溶于 的重蒸水中，加入 （）、冰乙酸，至充分溶解后用水定容至，室

7、温储存；染料：。检测的引物，见表。表埃博拉病毒 犚 犜 犘 犆 犚检测的引物引物序列（）扩增片段上游外引物 （）下游外引物 （）预期扩增片段为 注：等效的引物或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。检测步骤 核酸提取 吸取 血清样本加入溶解的 裂解液。脉冲混匀，置于室温 。短暂离心，加入 乙醇（）脉冲混匀。短暂离心。将 旋转柱置于 收集管中。吸取 中溶液 转移至旋转柱上，犵离心 ，将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。打开旋转柱盖，重复 。打开旋转柱盖，加入 洗液，盖紧盖子，犵离心 。将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。打开旋转柱盖，加入 洗液 ，盖紧盖子，犵离心

8、。将旋转柱放至干净的收集管上，犵再离心 。将旋转柱放至干净的 离心管上，丢弃包含过滤液的收集管。打开旋转柱盖，加入 室温平衡的缓冲液。盖紧盖子，室温放置 。犵离心 。收集滤出液，用于 扩增。或 储存 。犚 犜 犘 犆 犚检测 准备 反应液，设 反应体系，每个待检标本反应液的组成为：缓冲液，（），（），无 酶的 水，模板。同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为根据埃博拉病毒核苷酸序列体外转录的 片段；阴性对照模板为不含埃博拉病毒核酸的标本或无 酶的水。将 反应管置于 扩增仪上进行操作，反应程序为：逆转录 ，预变性 ；变性，复性，延伸，个循环；延伸 ；。犛 犖犜 凝胶电泳扩增结束后，在扩增产物

9、中加入 上样缓冲液，用含 的 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，用凝胶成像系统照相记录结果。结果判定 质量控制反应结果应同时符合以下个条件：阴性对照未出现特异性条带；阳性对照出现预期 大小的扩增条带。结果分析在实验结果有效情况下，如待测样品出现预期 大小的扩增条带，则可判断待测样品埃博拉病毒核酸 阳性，判断为阳性结果的样品可通过复检和核酸序列测定进行确认。如待测样品中未出现预期大小的扩增产物，则可判断待测样品埃博拉病毒核酸 阴性。测序对于首发病例，必需将 扩增产物进行序列测定，确定其碱基组成。使用 分析其与已公布的埃博拉病毒序列的同源性，才能判断扩增产物是否为埃博拉病毒核酸。实时荧光犚 犜 犘 犆

10、犚法 主要仪器本方法使用的主要仪器如下：荧光定量 仪；超净工作台；生物安全柜；高压灭菌锅；低温高速离心机：最大离心力 犵；旋涡振荡器；冰箱：、和；移液器：、和。主要试剂本方法使用的主要试剂如下：核酸提取试剂：用德国 公司 ）提取病毒核酸；实时荧光 通用试剂：，美国 公司产品）；）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。处理的无 酶的水；引物和探针：引物和探针序列见表。犛 犖犜 表埃博拉病毒实时荧光 犚 犜 犘 犆 犚检测的引物和探针引物探针名称序列（）扩增片段 预期扩增片段为 或 注：等效的引物和探针或

11、其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。为犜 犪 狇 探针，探针序列中前面带“”号的碱基表示 修饰碱基。核酸提取见 。加样准备实时荧光 反应液，设 反应体系，每个待检标本反应液的组成为：缓冲液、模板 。同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为根据埃博拉病毒核苷酸序列体外合成的 片段，阴性对照模板为不含埃博拉病毒核酸的标本或无 酶的水。实时荧光犚 犜 犘 犆 犚扩增反应在不同的荧光定量 仪上，犜 犪 狇 探针实时荧光 的反应条件略有不同。以 或 荧光定量 仪为例，实时荧光 检测扩增程序为：，；，（收集荧光信号），个循环。如使用其他仪器，应根据其他仪器的要求设置具体的反应条件。结果分析 阈值确定阈值

12、确定的方法对所有的样品都是统一的，一般是以荧光 反应的前个 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的 倍作为荧光阈值，以样品扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（值）。质量控制反应结果应同时符合以下个条件：阴性对照无扩增曲线；阳性对照 值 并有明显扩增曲线。结果判定 根据以下条件进行结果判定：无明显扩增曲线，判断为埃博拉病毒荧光 检测阴性；有明显扩增曲线，且 值，判断为埃博拉病毒荧光 检测阳性；犛 犖犜 有明显扩增曲线，且 值 的标本应重做，重做后只要出现扩增曲线，则判断为埃博拉病毒荧光 检测阳性，否则为阴性。阳性标本的确认：荧光 结果阳性的标本可进一步进行 扩

13、增。对于首发病例，必需对扩增片断测序和序列比对后，才能确认是否为埃博拉病毒核酸阳性。基因芯片法 主要仪器设备本方法使用的主要仪器如下：微阵列芯片点样系统；微阵列芯片扫描仪；芯片洗涤仪；芯片杂交仪；脱色摇床；基因扩增仪；低温高速离心机。主要试剂本方法使用的主要试剂如下：核酸提取试剂：用德国 公司 ）提取病毒核酸；逆转录试剂 ；聚合酶）；试剂?）；）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。核酸共沉剂：预杂交液、杂交液、洗液、洗液、洗液；包被芯片片基：！芯片点样液）；芯片盖玻片；随机引物：；染料标记的通用序列

14、引物：（）；埃博拉病毒基因芯片及阳性、阴性对照探针：探针序列见表。表埃博拉病毒基因芯片探针和对照探针探针名称序列（）犛 犖犜 表（续）探针名称序列（）注：等效的探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。犛 犖犜 基因芯片探针打印合成好的芯片探针干粉离心后，按合成量用 ！芯片点样液稀释成 ，充分混匀后各吸 至 孔板，用微阵列芯片点样系统将探针打印于 包被芯片片基上，每种探针打印个点，每个阵列包括阴性对照探针、阳性对照探针和空白点样液，打印好的芯片取出后放入湿度 的干净密封容器，过夜处理。病毒犚 犖 犃提取及逆转录病毒的 提取见 。提取好的 取于 反应管中，加入 随机引物，加热 后立即转到冰中速冻

15、 ，随后加入下列混合液：反应缓冲液，抑制剂，（），混匀，离心，保温 后，逆转录。全基因组扩增取上述全部 逆转录产物，加入 水，（），反应缓冲液，（），加热 后立即转到冰中速冻 ，补加 聚合酶，混匀，离心，保温，加热 使酶失活。扩增产物标记取上述 全 部 聚 合 酶 的 全 基 因 组 扩 增 产 物，补 加 下 列 混 合 液：?，染料标记的通用序列引物，水，混匀，离心，按 、，进行 个循环 扩增标记。标记产物纯化 扩增标记的 产物全部用核酸共沉剂进行纯化，干燥后室温保存于暗处备用。芯片预杂交将芯片浸入预热至 的预杂交液（，）中，放置，室温下用洗液（）清洗共次，每次用脱色摇床 犵轻摇 ，转至纯

16、水，放置，离心甩干芯片，然后于洁净处放置待用。芯片杂交在纯化的扩增标记样品沉淀管中加入 去离子水和 杂交液（去离子甲酰胺，鲑鱼精 ），振荡混匀，保温 ，然后 犵离心 ，取 样品于盖好盖玻片的芯片上。在杂交仪上 杂交，杂交腔两端各加上 含甲酰胺的保湿液，盖好，启动杂交程序进行杂交。芯片杂交后清洗杂交结束后，用镊子从杂交仪上轻轻取出芯片，注意不要触动盖玻片，立即浸入预先预热至 的洗液（，）中，上下抽动直至盖玻片滑落，将芯片转至芯片洗涤仪上，用预先设好的程序洗涤：洗液中静置 ，将洗液换成洗液（），静置 ，再换洗液静置 ，接着换洗液，静置 ，再换液（），静置 ，最后取出芯片，离心甩干芯片，待扫描检测。

17、犛 犖犜 芯片扫描将杂交清洗后的基因芯片放入基因芯片扫描仪进行扫描分析。质量控制结果应同时符合以下个条件，则可判定为杂交合格。阴性对照探针杂交信号的信噪比均值；基因芯片空白对照点杂交信号的信噪比均值；阳性对照探针杂交信号的信噪比均值。结果判定在阴性、阳性对照合格的基础上：目标基因探针杂交信号的信噪比均值 则判定为阳性信号；目标基因探针杂交信号的信噪比均值 并 则判定为可疑阳性；目标基因探针杂交信号的信噪比均值 则判定为阴性。犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸埃博拉病毒分子生物学检测方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲号（）北京市西城区三里河北街 号（）总编室：（）网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元