实验一 蛋白质的等电点测定和沉淀反应1.ppt

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1、实验一、蛋白质的等电点测定和沉淀反应实验一、蛋白质的等电点测定和沉淀反应一、目的一、目的1.1.蛋白质的两性解离性质和等电点蛋白质的两性解离性质和等电点2.2.学习测定蛋白质等电点的一种方法学习测定蛋白质等电点的一种方法3.3.加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识4.4.了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义 二、实验原理二、实验原理(一一)蛋白质的两性性质和等电点蛋白质的两性性质和等电点n Pr Pr 为两性电解质，除了含有自由羧基、氨基外，还有酚基为两性电解质，除了含有自由羧基、氨基外，还有酚基(Tyr)(Tyr)、巯基、巯

2、基(Cys)(Cys)、胍基胍基(Arg)(Arg)、咪唑基、咪唑基(His)(His)等可解离基团等可解离基团-酸性和碱性基团酸性和碱性基团 pH pI pH=pI pH pI等电点等电点:当溶液的当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数 目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极 移动，此时溶液的移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。值称为此种蛋白质的等电点。不同的蛋白质有不同的不同的蛋白质有不同的pI 蛋白质蛋白质 等电点等电点 蛋白质蛋白质 等电点等电点胃蛋白酶胃蛋白酶

3、1.0-糜蛋白酶糜蛋白酶8.3卵清蛋白卵清蛋白4.6-糜蛋白酶原糜蛋白酶原9.1血清蛋白血清蛋白4.7核糖核酸酶核糖核酸酶9.5-乳球蛋白乳球蛋白5.2细胞色素细胞色素C10.7 胰岛素胰岛素 5.3 溶菌酶溶菌酶 11.0血红蛋白血红蛋白6.7鱼精蛋白鱼精蛋白12.0等电点沉淀法等电点沉淀法 静电状态时蛋白颗粒之间的静电斥力最小，溶解度最小，易沉淀静电状态时蛋白颗粒之间的静电斥力最小，溶解度最小，易沉淀;猪胰腺提取胰岛素（猪胰腺提取胰岛素（pI=5.30-5.35），），可以先调节组织匀浆可以先调节组织匀浆pH呈碱性，使碱性蛋白沉淀析出，再调节组织匀浆呈碱性，使碱性蛋白沉淀析出，再调节组织匀

4、浆pH 呈酸性，使呈酸性，使酸性蛋白沉淀析出，然后调上清液酸性蛋白沉淀析出，然后调上清液pH至至5.3，得到胰岛素粗品。，得到胰岛素粗品。电泳：电泳：n溶液溶液pH值值pI，蛋白质带正电荷，向负极移动蛋白质带正电荷，向负极移动n溶液溶液pH值值 pI，蛋白质带负电荷，向正极移动蛋白质带负电荷，向正极移动n电泳方向和速度处决于：电泳方向和速度处决于：电荷种类、电荷数量、蛋白质分子大小电荷种类、电荷数量、蛋白质分子大小和形状和形状n电泳分离血清蛋白电泳分离血清蛋白-实验四实验四 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质n MW 1000-100000

5、0道尔顿道尔顿n颗粒直径颗粒直径1-100nm，具有胶体性质：具有胶体性质：布朗运动，丁达尔现象，布朗运动，丁达尔现象，不能透过半透膜，溶胶与凝胶互变，吸附现象等不能透过半透膜，溶胶与凝胶互变，吸附现象等n半透膜分离纯化蛋白质半透膜分离纯化蛋白质-透析法透析法n n 半透膜半透膜 蛋白质蛋白质n n 纯水纯水透析法透析法dialysis 半透膜半透膜-火棉胶、玻璃纸、塑料薄膜等火棉胶、玻璃纸、塑料薄膜等盐析法纯化的蛋白质脱盐盐析法纯化的蛋白质脱盐密度梯度离心法纯化的蛋白质脱氯化铯、蔗糖等小分子物质密度梯度离心法纯化的蛋白质脱氯化铯、蔗糖等小分子物质蛋白质是一种稳定的亲水胶体稳定的亲水胶体n水膜

6、（水化层）：水膜（水化层）：蛋白质分子表面有亲水基团，蛋白质分子表面有亲水基团，对水有较大吸引力，分子表面会吸附水（对水有较大吸引力，分子表面会吸附水（0.4克克水水/克蛋白质）。水膜使蛋白质颗粒彼此分开，克蛋白质）。水膜使蛋白质颗粒彼此分开，不易聚集而沉淀。不易聚集而沉淀。n带同种电荷：带同种电荷：同性相斥，使蛋白质分子彼此保持同性相斥，使蛋白质分子彼此保持一定距离，不易聚集而沉淀。一定距离，不易聚集而沉淀。(二二)、蛋白质的沉淀、蛋白质的沉淀precipitationn实质：破坏水膜或带同种电荷这种状况实质：破坏水膜或带同种电荷这种状况n 与变性后蛋白质沉淀有区别与变性后蛋白质沉淀有区别n

7、变性变性-构象变化构象变化-分子形状改变分子形状改变-分子表面亲水基团减分子表面亲水基团减少少-疏水基团增加疏水基团增加-蛋白质的水溶性下降蛋白质的水溶性下降-沉淀沉淀n 但也有例外：在偏酸或偏碱时有时表现为溶解状态但也有例外：在偏酸或偏碱时有时表现为溶解状态n沉淀沉淀-可能变性，也可能不变性，取决于沉淀的方法和条件可能变性，也可能不变性，取决于沉淀的方法和条件是否破坏了空间构象。是否破坏了空间构象。n沉淀蛋白质的方法：沉淀蛋白质的方法：盐析法盐析法n 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法n 生物碱沉淀法生物碱沉淀法n 重金属沉淀法重金属沉淀法1.盐析法salting-outn定义定义：n 在蛋白质水

8、溶液中，加入一定量中在蛋白质水溶液中，加入一定量中性盐（性盐（NH4）2SO4，NaCl，Na2SO4等使等使蛋白质沉淀的作用称为盐析蛋白质沉淀的作用称为盐析salting-out。n盐析原因：盐析原因：破坏了水膜；大量中和蛋白质破坏了水膜；大量中和蛋白质 颗粒上的电荷，使蛋白质成为颗粒上的电荷，使蛋白质成为 不带电荷的颗粒。不带电荷的颗粒。n盐析法优点盐析法优点：应用广泛，设备简单，操作方便，蛋应用广泛，设备简单，操作方便，蛋白质并不失活，在一定条件下可以重新溶解。白质并不失活，在一定条件下可以重新溶解。-用于制备活性蛋白质。用于制备活性蛋白质。n n盐析法缺点：盐析法缺点：混入大量中性盐，

9、脱盐混入大量中性盐，脱盐-透析法透析法n分段盐析法分段盐析法：不同蛋白质分子量不同，带电状况不不同蛋白质分子量不同，带电状况不一，盐析时所需的盐溶度不同，可以通过控制混合蛋白一，盐析时所需的盐溶度不同，可以通过控制混合蛋白质中的盐溶度，使各种蛋白质先后分别沉淀，从而达到质中的盐溶度，使各种蛋白质先后分别沉淀，从而达到分离目的分离目的。2.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法n能与水互溶的有机溶剂：乙醇，丙酮等能与水互溶的有机溶剂：乙醇，丙酮等n原因：原因：1）有机溶剂的介电常数小于水有机溶剂的介电常数小于水n 丙酮丙酮21，乙醇，乙醇26，水，水76n 蛋白质溶液中加入有机溶剂后，降低了溶剂的极蛋白质

10、溶液中加入有机溶剂后，降低了溶剂的极性，削弱了蛋白质与溶剂之间的相互作用，相应的增加性，削弱了蛋白质与溶剂之间的相互作用，相应的增加了蛋白质颗粒之间的相互作用。了蛋白质颗粒之间的相互作用。n 2）破坏水膜，起脱水作用。）破坏水膜，起脱水作用。n 有机溶剂与水的亲和力大。有机溶剂与水的亲和力大。n 同样可以通过控制混合蛋白质中的有机溶剂浓度，同样可以通过控制混合蛋白质中的有机溶剂浓度，使各种蛋白质先后分别沉淀，从而达到分离目的。使各种蛋白质先后分别沉淀，从而达到分离目的。注意点：注意点：1.浓度不能太高，加入时要不断轻轻搅拌，以浓度不能太高，加入时要不断轻轻搅拌，以 防局部浓度太高；防局部浓度太

11、高；2.低温操作：与水混合时会产生大量热量，引低温操作：与水混合时会产生大量热量，引 起蛋白质热变性；起蛋白质热变性；3.短时间。沉淀后，要迅速将蛋白质和有机溶短时间。沉淀后，要迅速将蛋白质和有机溶 剂分开。剂分开。优点：有机溶剂易蒸发除去。优点：有机溶剂易蒸发除去。3.生物碱试剂沉淀法生物碱试剂沉淀法生物碱：单宁酸（鞣酸）、苦味酸、磷钼酸、三氯生物碱：单宁酸（鞣酸）、苦味酸、磷钼酸、三氯 醋酸等醋酸等用于去杂蛋白用于去杂蛋白临床用于测定尿液蛋白质含量临床用于测定尿液蛋白质含量原因：原因：4.重金属盐沉淀法：重金属盐沉淀法：Pb 2+，Ag+，Hg2+，Cu 2+可以解除重金属中毒或去杂蛋白可

12、以解除重金属中毒或去杂蛋白 三、主要器材四、操作步骤n（一）酪蛋白等电点的测定n1）取同样规格的试管4支，加入各试剂，然后混匀。此时 4个管的pH依次为5.9、5.3、4.7、3.5。n2）各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点。HAc（二）蛋白质的沉淀及变性1、蛋白质的盐析 5ml5ml 卵清蛋白卵清蛋白+5 5ml ml 饱和饱和(NHNH4 4)2 2SOSO4 4 混匀，静置数分钟混匀，静置数分钟 有无沉淀？有无沉淀？倒出少量混浊液，加少量水倒出少量混浊液，加少量水清液清液 是否溶解？解释。是否溶

13、解？解释。添加添加 (NHNH4 4)2 2SOSO4 4 粉末至饱和粉末至饱和清蛋白沉淀清蛋白沉淀 加少量水加少量水 沉淀沉淀沉淀沉淀是否溶解？解释。是否溶解？解释。是否溶解？解释。是否溶解？解释。2 2、重金属离子沉淀蛋白质、重金属离子沉淀蛋白质 2ml2ml卵清蛋白卵清蛋白卵清蛋白卵清蛋白+1+12 2 滴滴滴滴 3%AgNO3%AgNO3 3 振荡，有无振荡，有无振荡，有无振荡，有无沉淀？沉淀？沉淀？沉淀？加水，沉淀是否溶解？为什么？加水，沉淀是否溶解？为什么？3、某些有机酸沉淀蛋白质、某些有机酸沉淀蛋白质 2ml2ml卵卵卵卵清清清清蛋蛋蛋蛋白白白白 +1ml 1ml 5%5%三三三

14、三氯氯氯氯乙乙乙乙酸酸酸酸 振振振振荡荡荡荡，有有有有无无无无沉沉沉沉淀？淀？淀？淀？放置片刻，放置片刻，放置片刻，放置片刻，加水加水 是否溶解？解释。是否溶解？解释。是否溶解？解释。是否溶解？解释。4 4、有机溶剂沉淀蛋白质、有机溶剂沉淀蛋白质 加入加入2 2mLmL蛋白质溶液蛋白质溶液+2 2mL95%mL95%乙醇。观察沉淀的生成（如果沉乙醇。观察沉淀的生成（如果沉淀不明显，加点淀不明显，加点NaClNaCl，混匀。混匀。5、乙醇引起的变性与沉淀 n取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂五、注意事项五、注意事项 等电点测定的实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相等电点测定的实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。当准确。六、实验报告六、实验报告 以表格形式总结实验结果，包括观察到的现象，分析评价以表格形式总结实验结果，包括观察到的现象，分析评价实验结果。实验结果。七、思考题七、思考题1 1、什么是蛋白质的等电点？、什么是蛋白质的等电点？2 2、在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？、在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？3 3、引起蛋白质沉淀的方法有哪些、引起蛋白质沉淀的方法有哪些?各有什么特点各有什么特点?