实验蛋白质的等电点测定和沉淀反应.ppt

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1、实验二、蛋白质实验二、蛋白质等电点测定及沉淀反应等电点测定及沉淀反应 一、实验目的一、实验目的1 1、了解蛋白质的两性解离性质、了解蛋白质的两性解离性质2 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法、学习测定蛋白质等电点的一种方法3 3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。4 4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。5 5、了解蛋白质变性与沉淀的关系。、了解蛋白质变性与沉淀的关系。二、实验原理二、实验原理蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡：列平衡：蛋白质分子的解离状态和解

2、离程度受溶液的酸蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的碱度影响。当溶液的PHPH达到一定数值时，蛋达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的此时溶液的pHpH值称为此种蛋白质的等电点。值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有特异的等电点。不同蛋白质各有特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法

3、是测其溶解度最低时的溶点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液液pHpH值。值。本实验通过观察不同本实验通过观察不同pHpH溶液中的溶解度以测溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同pHpH值值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的沉淀出现最多的缓冲液的pHpH值即为酪蛋白的值即为酪蛋白的等电点。等电点。在在水水溶溶液液中中的的蛋蛋白白质质分分子子由由于于表表面面生生成成水水化化层层和和双双电电层层而而成成为为稳稳

4、定定的的亲亲水水胶胶体体颗颗粒粒，在在一一定定的的理理化化因因素素影影响响下下，蛋蛋白白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为蛋白质的沉淀反应可分为两类。两类。v可逆的沉淀反应可逆的沉淀反应 此此时时蛋蛋白白质质分分子子的的结结构构尚尚未未发发生生显显著著变变化化，除除去去引引起起沉沉淀淀的的因因素素后后，蛋蛋白白质质的的沉沉淀淀仍仍能能溶溶解解于于原原来来的的溶溶剂剂中中，并并保保持持其其天天然然性性质质而而不不变变性性。如如大大多多数数蛋蛋白白质质的的盐盐析析作作用用或或在在低低温温下下用用乙乙醇醇（或或丙丙酮酮）短短时时间间作作用用于于蛋蛋

5、白白质质。提提纯纯蛋蛋白白质质时时，常常利利用用此此类反应。类反应。v不可逆沉淀反应不可逆沉淀反应此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。于此类。蛋蛋白白质质变变性性后后，有有时时由由于于维维持持溶溶液液稳稳定定的的条条件件仍仍然然存存在在（如如电电荷荷），并并不不析析出出。因因此此变变性性蛋蛋白白质质并并不不一一定定都都表表现现为为沉沉淀淀

6、，而而沉沉淀淀的的蛋蛋白白质质也也未未必必都都已已变变性。性。三、试剂器材三、试剂器材1 1、实验材料：、实验材料：鸡蛋清鸡蛋清 牛乳牛乳2 2、仪器设备：、仪器设备：水浴锅水浴锅 温度计温度计锥形瓶锥形瓶 100mL100mL容量瓶容量瓶吸管吸管试管及试管架试管及试管架 0.4%0.4%酪蛋白乙酸钠溶液酪蛋白乙酸钠溶液 取酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将取酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入所得的蛋白质悬胶液移入200mL200mL锥形瓶内，用少锥形瓶内，用少量量40504050的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入形瓶内。

7、加入10mL 1mol/L10mL 1mol/L醋酸钠溶液。把锥形瓶放醋酸钠溶液。把锥形瓶放到到5050水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移到白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移到100mL100mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。3、试剂、试剂醋酸溶液醋酸溶液 100mL 100mL0.10 mol/L0.10 mol/L醋酸溶液醋酸溶液 300mL 300mL0.01 mol/L0.01 mol/L醋酸溶液醋酸溶液 50mL 50mL蛋白质溶液蛋白质溶液 500mL 50

8、0mL 5%5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清（新鲜鸡蛋清 ：水：水=1:9=1:9）pH4.7 pH4.7 醋酸醋酸-醋酸钠的缓冲溶液；醋酸钠的缓冲溶液；3%3%硝酸银溶液；硝酸银溶液；5%5%三氯乙酸溶液；三氯乙酸溶液；95%95%乙醇；乙醇；饱和硫酸铵溶液；饱和硫酸铵溶液；硫酸铵结晶粉末；硫酸铵结晶粉末；0.1 M0.1 M盐酸溶液；盐酸溶液；0.1 M0.1 M氢氧化钠溶液；氢氧化钠溶液；0.05 M0.05 M碳酸钠溶液；碳酸钠溶液；0.1 M0.1 M醋酸溶液；醋酸溶液；甲基红溶液甲基红溶液四、实验操作四、实验操作（一）酪蛋白等电点的测定一）酪

9、蛋白等电点的测定（1 1）取同样规格的试管）取同样规格的试管4 4支，按下表顺序分别支，按下表顺序分别 精确地加入各试剂，然后混匀。精确地加入各试剂，然后混匀。试管号试管号蒸馏水蒸馏水mL0.01M醋酸醋酸mL0.1M醋酸醋酸mL1.0M醋酸醋酸mL18.40.6-28.7-0.338.0-1.047.4-1.6（2 2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL1mL，加一管，摇匀一管。此时加一管，摇匀一管。此时1 1、2 2、3 3、4 4管的管的pHpH依依次为、。观察其混浊度。静置次为、。观察其混浊度。静置10 10分钟后，再分钟后，再观察其混浊度。最

10、混浊（有颗粒沉淀）的一管观察其混浊度。最混浊（有颗粒沉淀）的一管pHpH即为酪蛋白的等电点。即为酪蛋白的等电点。（二）蛋白质沉淀实验（二）蛋白质沉淀实验1 1蛋白质的盐析蛋白质的盐析：无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯：无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又

11、能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。过程。加加5%5%卵清蛋白溶液卵清蛋白溶液5 ml5 ml于试管中，再加等量的于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管中内容物过滤，观察是否溶解，为什么？将管中内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。时析出的沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的取出部分清蛋白，加

12、少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。再溶解。2 2重金属离子沉淀蛋白质：重金属离子沉淀蛋白质：重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。复合物。取取1 1支试管，加入蛋白质溶液支试管，加入蛋白质溶液2 ml2 ml，再加，再加3%3%硝酸银溶液硝酸银溶液1212滴，振荡试管，有沉淀滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？么？3 3有机酸沉淀蛋白质：有机酸沉淀蛋白质：取取1 1支试管，加入蛋白质溶液支试管，加入蛋白质溶液2 ml2 ml，再加，再加1

13、 1 ml5%ml5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。4 4有机溶剂沉淀蛋白质：有机溶剂沉淀蛋白质：取取1 1支试管，加入支试管，加入2 ml2 ml蛋白质溶液，再加蛋白质溶液，再加入入2 ml95%2 ml95%乙醇。混匀，观察沉淀的生成。乙醇。混匀，观察沉淀的生成。5 5乙醇引起的变性与沉淀乙醇引起的变性与沉淀：取取3 3支试管，编号。依下表顺序加入试剂：支试管，编号。依下表顺序加入试剂：试剂试剂 mL管号管号 5%卵卵清蛋

14、白清蛋白0.1M氢氧化氢氧化钠钠0.1M盐酸盐酸95%乙乙醇醇 pH4.7缓冲液缓冲液 111121113111振摇混匀后，观察各管有何变化。放置振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水片刻，向各管内加水8 ml8 ml，然后在第，然后在第2 2、3 3号管中各加一滴甲基红，再分别用号管中各加一滴甲基红，再分别用0.1 M0.1 M醋酸溶液及醋酸溶液及0.05 M0.05 M碳酸钠溶液中和之。观碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加再加0.1 M0.1 M盐酸溶液数滴，观察沉淀的再盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全

15、部现象。溶解。解释各管发生的全部现象。五、实验结果五、实验结果管号 pH值混浊度 解释现象1234（一）蛋白质等电点测定（一）蛋白质等电点测定（二）蛋白质的盐析（二）蛋白质的盐析 1 1蛋白质的盐析蛋白质的盐析 现现 象象 解解 释释蛋白质溶液中加蛋白质溶液中加硫酸铵溶液硫酸铵溶液 加水加水上清液中加硫酸上清液中加硫酸铵粉末铵粉末 加水加水2 2重金属离子沉淀蛋白质重金属离子沉淀蛋白质现现象象解解释释蛋白质溶液蛋白质溶液中加硝酸银中加硝酸银沉淀中加水沉淀中加水3 3有机酸沉淀蛋白质有机酸沉淀蛋白质现现象象解解释释蛋白质溶液中蛋白质溶液中加三氯乙酸加三氯乙酸沉淀中加水沉淀中加水4 4有机溶剂沉淀蛋白质有机溶剂沉淀蛋白质现现象象解解释释5 5乙醇引起的变性与沉淀乙醇引起的变性与沉淀管管 号号操作操作现现 象象解解 释释1振荡混匀振荡混匀加数滴盐酸加数滴盐酸2振荡混匀振荡混匀醋酸中和醋酸中和加数滴盐酸加数滴盐酸3振荡混匀振荡混匀碳酸钠中和碳酸钠中和加数滴盐酸加数滴盐酸思考题思考题1.1.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？2.2.氯化汞为何能做为杀菌剂？氯化汞为何能做为杀菌剂？3.3.什么是蛋白质的等电点？什么是蛋白质的等电点？4.4.在在等等电电点点时时，蛋蛋白白质质溶溶液液为为什什么么容容易易发发生生沉淀沉淀？