医学专题—细胞核和线粒体的分离和观察.ppt

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1、细胞核与线粒体的分级分离细胞核与线粒体的分级分离 第一页，共二十页。1.1.初步了解细胞内各种成分的分离方法初步了解细胞内各种成分的分离方法 2 2、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分离方法分离方法 3 3、对分离得到对分离得到(d do)(d do)的细胞核及线粒体进行的细胞核及线粒体进行活性鉴定。活性鉴定。一、实验一、实验(shyn)目的目的第二页，共二十页。细胞器分离细胞器分离(fnl)(fnl)基本步骤基本步骤二、实验二、实验(shyn)原理原理细胞细胞(xbo)破碎破碎分离、纯化分离、纯化细胞器鉴定细胞器鉴定第三页，共二十页。（一）细胞破碎（一）细胞

2、破碎(p su)(p su)的方法的方法1.杆状玻璃匀浆器法2.高速组织捣碎机法3.超声波处理法4.化学裂介法5.反复冻融法二、实验二、实验(shyn)原理原理第四页，共二十页。细胞破碎的注意事项：细胞破碎的注意事项：1 1、匀浆介质：、匀浆介质：常用介质是缓冲的常用介质是缓冲的蔗糖水溶液蔗糖水溶液（0.25mol/L）。它比较近细胞质的分散相，具有足够渗。它比较近细胞质的分散相，具有足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂透压，防止颗粒膨胀破裂(pli)(pli)，对酶活性干扰小，在，对酶活性干扰小，在pH7.2-7.4pH7.2-7.4的条件下细胞器不易发生聚集。的条件下细胞器不易发生聚集。2 2、尽

3、可能在低温、尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。条件下进行，避免酶失活。3 3、若是采用、若是采用低渗方式低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中的破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束不要时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束不要超过超过5 5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长，导致分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长，导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。第五页，共二十页。（二）分离纯化的方法（二）分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状根据细胞器的大小、形状(xngzhun)(xngzhun)、密度等物理

4、特、密度等物理特性差异，性差异，离心离心成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术 离心离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法 主要包括主要包括差速离心、密度梯度离心差速离心、密度梯度离心等方法。等方法。二、实验二、实验(shyn)原理原理第六页，共二十页。差速离心法根根据据颗颗粒粒大大小小和和密密度度的的不不同同存存在在的的沉沉降降速速度度差差别别，分分级级增增加加离离心心力力，从从试试样样中中依依次次分分离离出出不不

5、同同组组分分的的方方法法。从从低低速速到到高高速速逐逐级级沉沉淀淀分分离离，一一般般用用于于分分离离沉沉降降系系数数相相差差较较大大（10倍倍及及以以上上）的的颗粒。颗粒。优优点点是是：操操作作简简单单，离离心心后后用用倾倾倒倒法法即即可可将将上上清清液液与与沉沉淀淀分分开开，并并可使用容量较大的角式转子。可使用容量较大的角式转子。缺缺点点是是：分分离离效效果果差差，不不能能一一次次得得到到纯纯颗颗粒粒；须须经经反反复复悬悬浮浮和和离离心心加加以以纯纯化化。壁壁效效应应严严重重，特特别别是是当当颗颗粒粒很很大大或或浓浓度度很很高高时时，在在离离心心管管一一侧侧会会出出现现沉沉淀淀；颗颗粒粒被被

6、挤挤压压，离离心心力力过大、离心时间过长会使颗粒变形过大、离心时间过长会使颗粒变形(bin xng)(bin xng)、聚集而失活。、聚集而失活。第七页，共二十页。第八页，共二十页。密度梯度离心(lxn)下次(xi c)课讲第九页，共二十页。（三）细胞器的鉴定分析（三）细胞器的鉴定分析 分析分级分离得到的组分，可用分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定功能鉴定。细胞器标记细胞器标记(bioj)(bioj)酶酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如的主要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶线

7、粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶，该酶使使詹纳斯绿詹纳斯绿B B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。（也可使用罗丹明而胞质中的染料被还原成无色。（也可使用罗丹明123123或或MitoTrackerMitoTracker等荧光探针标记法等）等荧光探针标记法等）细胞核：细胞核：DNADNA亚甲基蓝、甲苯胺蓝、亚甲基蓝、甲苯胺蓝、HoechstHoechst染料等染料等第十页，共二十页。方法方法(fngf)和步骤和步骤（一）细胞核的分离提取（一）细胞核的分离提取 1、肝脏肝脏，剪成小块剪成小块(去除结缔组织

8、去除结缔组织)尽快置于盛有尽快置于盛有0.9NaCl的烧杯中，反复的烧杯中，反复洗涤洗涤，尽量除去血污，用，尽量除去血污，用滤纸滤纸(lzh)吸去表面的液体。吸去表面的液体。2、称取肝组织、称取肝组织1 g，剪碎；用预冷的，剪碎；用预冷的0.25 molL蔗糖蔗糖-0.05molL Tris-HCI缓冲液，缓冲液，pH7.4（0.25moll蔗糖蔗糖0.003moll氯化钙）溶液洗氯化钙）溶液洗涤数次。涤数次。第十一页，共二十页。3、按每克肝加按每克肝加8ml-9ml预冷的预冷的0.25molL蔗糖蔗糖 0.05m/L Tris-HCI溶液溶液，用，用高速组织匀浆器高速组织匀浆器匀浆（已完匀浆

9、（已完成）成）4、取一定量匀浆液，在、取一定量匀浆液，在04冰浴中用冰浴中用玻玻璃匀浆器璃匀浆器将肝再次匀浆（匀浆器下端浸入盛有将肝再次匀浆（匀浆器下端浸入盛有冰块冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入(ch r)管管中，上下转动研磨中，上下转动研磨）（因已事先匀浆，本步骤研（因已事先匀浆，本步骤研磨次数和时间可缩短）磨次数和时间可缩短）5、肝匀浆用双层纱布过滤，滤液制一张、肝匀浆用双层纱布过滤，滤液制一张涂片涂片,自自然干燥然干燥.第十二页，共二十页。第十三页，共二十页。6 6、滤液以、滤液以2500rpm2500rpm，离心，离心1515分

10、钟；分钟；(1)(1)缓缓取缓缓取上清液上清液，移入高速离心管中，保存，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；(2)(2)同时涂一张同时涂一张上清液片上清液片做好标记，自然干做好标记，自然干燥；燥；(3)(3)余下余下(yxi)(yxi)的的沉淀物沉淀物进行下一步骤。进行下一步骤。第十四页，共二十页。7 7、用、用6ml 6ml 蔗糖一蔗糖一Tris-HCI溶液悬浮沉淀物，溶液悬浮沉淀物，以以2500rpm2500rpm离心离心1515分钟弃上清，将残留液体分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片用吸管吹打成悬液，滴一滴于

11、干净的载玻片上，上，涂片涂片，自然干燥。，自然干燥。8 8、将、将、涂片用涂片用l l甲苯胺甲苯胺(bn n)(bn n)兰兰（或亚甲基蓝）（或亚甲基蓝）染色后盖片即可观察。染色后盖片即可观察。第十五页，共二十页。（二）高速离心分离提取线粒体（二）高速离心分离提取线粒体1、将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯、将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯(shobi)中取出，配平后，以中取出，配平后，以17000g离心离心20分钟，弃分钟，弃上清，留取沉淀物。上清，留取沉淀物。（本实验用（本实验用12000rpm,非冷冻离心）非冷冻离心）2、加入蔗糖、加入蔗糖-Tris-Hcl 1ml，用

12、吸管吹打成悬液，以，用吸管吹打成悬液，以17000g离心离心20分钟分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入淀物，加入0.1ml蔗糖蔗糖-Tris-Hcl氯化钙溶液混匀成悬氯化钙溶液混匀成悬液液(可用牙签可用牙签)。第十六页，共二十页。3、取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于、取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净干净(gnjng)载玻片上载玻片上(分别分别标记标记、涂片涂片)，各滴一滴，各滴一滴1詹纳斯绿詹纳斯绿b染液染染液染20分钟分钟,盖片观察。盖片观察。4、油镜观察。、油镜观察。第十七页，共二十页。注意事项1、各步骤加入的溶液(rngy)的量需根据离心管

13、的大小自行调整。2、线粒体的染色必须先染色20分钟后盖盖片，以便充分氧化。3、本实验所有操作本应在低温下进行，但实验室的冷冻离心机损坏，用普通离心机离心，温度和转速都和实验步骤有差别。第十八页，共二十页。实验报告方法：按照实际的操作记录结果：描述5张涂片镜下情况讨论：1、实际情况和理论预期是否符合？为什么？2、本实验步骤(bzhu)有哪些可以改进的地方？第十九页，共二十页。内容(nirng)总结细胞核与线粒体的分级分离。2、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分离方法。从低速到高速逐级沉淀分离，一般用于分离沉降系数相差较大（10倍及以上）的颗粒。8、将、涂片(t pin)用l甲苯胺兰（或亚甲基蓝）染色后盖片即可观察。1、各步骤加入的溶液的量需根据离心管的大小自行调整。2、线粒体的染色必须先染色20分钟后盖盖片，以便充分氧化。2、本实验步骤有哪些可以改进的地方第二十页，共二十页。