细胞分选技术.ppt

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1、StemCell Technologies Inc.细胞分选产品细胞分选产品细胞分选和基本原理细胞分选是把一种细胞从多细胞样品中分离出来用抗体标记细胞，同时被用的抗体被萤光标记或连接免疫磁珠或其它利用萤光和免疫磁珠的特性来分离细胞细胞分选常用方法密度梯度离心(Ficoll)离心抗体标记分离1.免疫密度离心2.免疫磁珠3.流式正选正选 和和 负选负选正选正选需要得细胞需要得细胞标记需要得细胞标记需要得细胞需要得细胞需要得细胞标记不需要得细胞标记不需要得细胞负选负选正选正选 只需要一种抗体 分离出的细胞纯度高 对于比例小的细胞群，正选容易得到高纯度正选和负选的比较正选和负选的比较优点优点负选负选

2、需要的细胞没有被抗体等标记 对需要的细胞，不需要特异性的细胞标记缺点缺点 需要多种抗体标记不需要的细胞 需要特异性的靶细胞标记 可能引起细胞活化细胞分选产品细胞分选产品StemCell Technologies Inc.的细胞分选原理利用抗体四聚体(Tetrameric Antibody Complex,TAC)来分选细胞 TACCell磁珠磁珠直接标记直接标记TACCell磁珠磁珠间接标记间接标记适用于人的全血细胞样品是一种负选方法基本原理：抗体标记和免疫密度离心法需要的仪器：离心机Direct Labeling of Human Cells不需要的细胞不需要的细胞离心离心把细胞样品置于把细

3、胞样品置于密度分离液上密度分离液上分选的过程标记标记把把RosetteSep 抗抗体混合液加入细胞体混合液加入细胞样品中样品中室温下室温下20分钟分钟用缓冲液用缓冲液稀释稀释收集收集的密度分离液DM-L为了最大限度回收淋巴细胞，StemCell专门研制了一种适合RosetteSep的密度分离液 DM-LDM-L 的密度：1.081 g/mLDM-L 的渗透压与人外周血的渗透压相同(iso-osmolar)适用于以下的淋巴细胞分选:CD3+T cells-CD8+T cellsCD4+T cells-B cellsDensity of Fresh LeukocytesFrom:“Centrifu

4、gation Techniques III”,Nycomed Amersham MonocytesLymphocytesBasophilsNeutrophilsEosinophilsErythrocytes1.0601.0701.0801.0901.100Density in g/mLDM-L:1.081 g/mLFicoll:1.077 g/mL低温冷藏的外周血单个核细胞人 和 小鼠脾细胞负选,只需要离心机可以同时分选多份样品取决于离心机的容量分选的细胞量在106 cells in Eppendorf -109 cells in 50 mL tube 适用于低温冷藏的人外周血单个核细胞(PB

5、MC)和小鼠脾细胞的特点 Sep直接标记人的细胞Anti-cell Anti-particle Tetrameric AntibodyComplex(TAC)Dense Particle(1m mm)Unwanted Cell间接标记小鼠的细胞 Tetrameric AntibodyComplex(TAC)BiotinylatedAntibody Anti-Anti-Biotin ParticleDense Particle(1m mm)Unwanted CellSpinSep 的分选过程Label Layer&Spin Collect1.Antibody Cocktail2.Anti-Bio

6、tin TAC(mouse only)3.Dense Particles4.Layer over SpinSep Density Medium 5.Spin 10-20min at 1200 xg6.Collect almost entire volume 7.Wash to remove Density Medium的细胞分选资料 人的人的外周血细胞外周血细胞(PBMC)小鼠的脾细胞小鼠的脾细胞Values are the mean SD新型，高效，易行的免疫磁珠分选技术新：不用柱子，只需用磁极，所用的磁珠很小高效：效率-分选过程不用洗细胞(省时省力);效果-分选的细胞纯度高易：操作过程简单

7、易行广：可做正选和负选适应性强：在理论上可以分选任何一种细胞 Anti-Anti-Cell ParticleTetrameric AntibodyComplex(TAC)Magnetic Nanoparticle(160 nm)直接标记人的细胞直接标记人的细胞CellMagnetic Nanoparticle(160 nm)Tetrameric AntibodyComplex(TAC)Biotin/FluoAntibody Anti-Anti-biotin/Fluo Particle 间接标记小鼠细胞间接标记小鼠细胞CellRelative Sizes of Magnetic Particle

8、s used in Cell SeparationCell的细胞分选过程 Ab(TAC)(人人)Abbiotinanti-biotin TAC(小鼠小鼠)标记标记放置磁极中放置磁极中倒出未标记的细胞倒出未标记的细胞分选分选结合磁珠结合磁珠加入免疫磁珠加入免疫磁珠孵育后稀释孵育后稀释正选资料人的外周血细胞人的外周血细胞(PBMC)小鼠脾或骨髓细胞小鼠脾或骨髓细胞负选资料人的外周血细胞人的外周血细胞(PBMC)小鼠脾细胞小鼠脾细胞可正选或去除任何一种细胞PE 标记的抗体分选KitFITC 标记的抗体分选KitBiotin 标记的抗体分选KitCell细胞分选常见的问题分选方法的选择样品种类样品数量

9、每次需要分选的细胞数常见问题样品的前处理Ficoll离心机全血和单采的细胞细胞计数稀释液细胞数常见问题分选过程中细胞浓度缓冲液细胞混匀动作要点Calculating Purity and Recovery%Purity=#desired cells in enriched fraction x 100#total nucleated cells in enriched fraction=%of total events in the desired cell gate(FACS profile)%Recovery=#desired cells in enriched fraction x 10

10、0#desired cells in start=(%purity in enriched)x(total nucleated cells in enriched)x 100(%purity in start)x(total nucleated cells in start)FACS GatepanNK+Selected from Mo SpleenStartNK+SelectedData analysis的技术要领细胞稀释后，用吸管混匀细胞（不要倒置试管）倒出未标记的细胞时，让液体连续流淌，试管停留在最后的位置约2秒钟，但不要刻意抖下最后一滴细胞液Product Information Ahttp:/ CatalogueCombined Procedure/PIS/Product ProfileTechnical Bulletins