荧光和荧光光谱.ppt

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1、Fluorescence&Spectroscopy 荧光和荧光光谱荧光和荧光光谱 良好的天平可测出良好的天平可测出105克的物质，微量化学分克的物质，微量化学分析可测出析可测出109克的物质，光谱分析可测出克的物质，光谱分析可测出1010克克的物质，荧光分析可测出的物质，荧光分析可测出10111012克物质，克物质，一般的放射分则可测出一般的放射分则可测出10181019克的物质克的物质(请参见：任时仁请参见：任时仁 编著编著“生物学中的放射必核技术生物学中的放射必核技术”，北京大学出版社，北京大学出版社，1997：P173；潘中允潘中允 主编主编“简明核医学简明核医学”，北京医科大与中国协和

2、医科大联合出版社，北京医科大与中国协和医科大联合出版社，1990：P139)。因此，荧光分析法和放射分析法，尤其是后因此，荧光分析法和放射分析法，尤其是后者，是目前最好的可用于对超微量物质进行高灵者，是目前最好的可用于对超微量物质进行高灵敏性测定的分析方法。敏性测定的分析方法。10-1810-16荧光光谱法特点荧光光谱法特点灵敏度高、选择性强、用样少、方法灵敏度高、选择性强、用样少、方法简便以及能提供较多的物理参数等优点。简便以及能提供较多的物理参数等优点。用途广泛，用途广泛，如可用于研究溶液中蛋如可用于研究溶液中蛋白质构象。白质构象。By Felix A.Carroll,Perspectiv

3、es on Structure and Mechanism In Organic chemistryBrooks/Cole Publishing Company,1998KASHA RULEPolyatomic molecular entities luminesce with appreciable yield only from the lowest excited state of a given multiplicity.There are exceptions to this rule.KASHA-VAVILOV RULEThe quantum yield of luminescen

4、ce is independent of the wavelength of exciting radiation.There are exceptions to this rule.Anomalous Fluorescence Patterns in CoralsWe have noticed several kinds of anomalous patterns in corals that show up clearly in fluorescence but are not visible under white-light illumination.These include:bri

5、ght or dark patches within areas of more uniform fluorescence isolated patches of fluorescent color color patterns that are only seen in fluorescence The significance of these effects is completely unknown,but they almost certainly point to underlying differences in internal chemistry.White-light(le

6、ft)and fluorescence(right)photographs of a coral,Roatan,Honduras.Note the yellow-fluorescent area in the photograph on the right that is not evident in the other image.2。基本知识：。基本知识：（.激发光谱与发射光谱激发光谱与发射光谱日立 激发光光源-激发单色器-比色杯-透射光|荧光|荧光单色器|探测器(计算机)荧光光度计示意图荧光熄灭剂荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质。如：引起荧光熄灭的物质。如：卤素离子，卤素离子，重金属离子，

7、重金属离子，硝基化合物，硝基化合物，O2等。等。Protein:Fluorescence?在蛋白质中，能发射荧光的氨基酸残基，只有在蛋白质中，能发射荧光的氨基酸残基，只有:Try(348 nm),Tyr(303 nm):Try(348 nm),Tyr(303 nm)和和Phe(282 nm)Phe(282 nm)。个。个别蛋白质含有黄素腺嘌呤二核苷酸别蛋白质含有黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)(FAD)，也能发，也能发射荧光。射荧光。荧光光谱法是研究水溶液中蛋白质分子构象的荧光光谱法是研究水溶液中蛋白质分子构象的一种新方法：一种新方法：通过测定蛋白质分子的自身荧光；通过测定蛋白质分子的自身荧光；另

8、另一是向蛋白质的特殊部位，引入荧光探测剂，一是向蛋白质的特殊部位，引入荧光探测剂，然后然后测定荧光探测剂的荧光。测定荧光探测剂的荧光。芳香族类(全部共三种氨基酸):向蛋白质分子引入荧光探测剂，运用荧向蛋白质分子引入荧光探测剂，运用荧光偏振法，可以测定：蛋白质分子的聚合与解光偏振法，可以测定：蛋白质分子的聚合与解离；抗原与抗体的反应机制；不同蛋白质分子离；抗原与抗体的反应机制；不同蛋白质分子相互作用等。相互作用等。氨基的修饰氨基的修饰Lys:+NH3-CH(COO-)-C4H8-NH3+For Example:NaBH4Cys:+NH3-CH(COO-)-CH2-SHCircadian Rhyt

9、hms in RNase A(Left,a:30 C;b:37 C)and DNA(Poly(dA*dT)-EB)(He,Y.J.et al.,Medical Hypotheses 2000,55(3):253-256)Fluorescence(A.u.)Time(hr)in Washington DC,12:00(Noon)is starting pointDNA:Fluorescence?NO.In experiment:DNA+EB=high Fluo.Mechanism:Intercalation(嵌入)A-B-Z-DNAZ-DNA:GC(GC)nHigh SaltMechanism:

10、Intercalation(嵌入)Circadian Rhythms in RNase A(Left,a:30 C;b:37 C)and DNA(Poly(dA*dT)-EB)(He,Y.J.et al.,Medical Hypotheses 2000,55(3):253-256)Fluorescence(A.u.)Time(hr)in Washington DC,12:00(Noon)is starting pointDNA Sequence modification(DNA序列修饰序列修饰)Is it OK for Z-DNA Fluoresence labelling?-NO!Circadian Rhythms in Ethidium Bromide(He,Y.J.et al.,Medical Hypotheses 2000,54(5):783-785)实验内容实验内容:溴乙锭的荧光光谱性质与温度依赖性溴乙锭的荧光光谱性质与温度依赖性1.溴乙锭溴乙锭(EB)的激发光谱的激发光谱;2.EB的发射光谱的发射光谱;3.荧光强度与温度的关系荧光强度与温度的关系.4.目的：理解荧光的原理和掌握测定荧光目的：理解荧光的原理和掌握测定荧光的方法的方法日立The EndThank You!