临床科研选题与科研设计.ppt

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1、临床科研选题与科研设计临床科研选题与科研设计（做科研型医生）做科研型医生）中国医学科学院基础医学研究所中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础医学院北京协和医学院基础医学院以几个案例作例子来阐述以几个案例作例子来阐述 Idea（新鲜）（创新点）（新鲜）（创新点）Design 如何如何(从哪几方面从哪几方面)来验证，它来验证，它们的逻辑关系们的逻辑关系 Methods（逻辑，内在联系）（逻辑，内在联系）新发新发SLE患者（创新点）患者（创新点）调节性调节性 T T细胞的细胞的研究研究(表面标志表面标志CD25与转录因子与转录因子Foxp3 的的表表达、细胞的抑制作用、其临床意义）达、细胞的

2、抑制作用、其临床意义）国外的国外的SLESLE患者绝大多数有激素或细胞毒患者绝大多数有激素或细胞毒药物治疗的经历药物治疗的经历案例一案例一 自身免疫应答靶抗原的的自身免疫应答靶抗原的的“暴露暴露”或形成（隐蔽抗原）或形成（隐蔽抗原）微生物感染激活自身反应性微生物感染激活自身反应性淋巴细胞（分子模拟）淋巴细胞（分子模拟）协同刺激分子的异位表达协同刺激分子的异位表达 多克隆淋巴细胞的非特异性多克隆淋巴细胞的非特异性活化（超抗原）活化（超抗原）免疫调节紊乱（包括免疫调节紊乱（包括调节性调节性T T细胞细胞数量减少或功能减弱）数量减少或功能减弱）其它其它自身免疫病发病的免疫学因素自身免疫病发病的免疫学

3、因素CD4+CD25+调节性调节性T细细胞（其抑制功能需胞（其抑制功能需Foxp3转录因子表达）转录因子表达）调节性调节性T细胞细胞案例一涉及的案例一涉及的3项研究项研究研究研究新发新发SLE患者周围血中患者周围血中CD4+T细胞的细胞的CD25与与FoxP3表达，及表达，及Glucocorticosteroid/cyclophosphamide治疗对治疗对CD25与与FoxP3 在在CD4+T细胞细胞表达表达的影响。的影响。研究对象为研究对象为24例新发活动期例新发活动期SLE患者患者、20例新发非活动期例新发非活动期SLE患者患者、21例例年龄性别相合的正常志愿者。分离周围血的单个核细胞，

4、用流式细胞仪检年龄性别相合的正常志愿者。分离周围血的单个核细胞，用流式细胞仪检测测CD4 T细胞细胞CD25与与FoxP3的表达。的表达。发现发现FoxP3在在新发新发SLE患者患者CD4+CD25+T 细胞的表达下降，在细胞的表达下降，在CD4+CD25-T 细胞细胞 的的表达增强。还检测了表达增强。还检测了Glucocorticosteroid与与cyclophosphamide治疗治疗对对FoxP3在在CD4+CD25+和和CD4+CD25-T 细胞表达细胞表达的影响的影响第第1项研究：项研究：Reduction of Foxp3 levels in CD4+CD25high T cel

5、ls in patients with new-onset systemic lupus erythematosus.Clin Exp Immunol.2008;153(2):182-7.研究研究新发新发SLE患者患者周围血周围血CD4+CD25-Foxp3+T细胞的临床意义细胞的临床意义检测检测1010例活动期、例活动期、1111例非活动期新发例非活动期新发 SLE患者、及患者、及1111例健康志愿者。例健康志愿者。用流式细胞仪分析用流式细胞仪分析Foxp3与与CD25在在CD4 T细胞的表达。分离细胞的表达。分离CD4+CD25+与与CD4+CD25-T细胞，检测它们对细胞，检测它们对T

6、T细胞增殖的影响。细胞增殖的影响。G检测检测CD4+CD25-T细胞与其他临床指标（如抗细胞与其他临床指标（如抗dsDNA、尿蛋白、血、尿蛋白、血清清C3水平、水平、SLEDAI）的相关性）的相关性这个故事并不复杂，内容较简单，文内仅这个故事并不复杂，内容较简单，文内仅2 2张图与张图与1 1个表格。但创新点个表格。但创新点明显，文章发表于明显，文章发表于Ann Rheum Dis.2008;67(7):1037-40.Impact Ann Rheum Dis.2008;67(7):1037-40.Impact fector 7.188fector 7.188。第第2项研究：项研究：Clini

7、cal significance of increased CD4+CD25-Foxp3+T cells in patients with new-onset systemic lupus erythematosus 第第3项研究项研究:Are CD4+CD25 Foxp3+cells in untreated new-onset lupus patients regulatory T cells?Arthritis Res Ther 2009;11(5):R153研究新发研究新发SLE 患者周围血中的患者周围血中的CD4+CD25-Foxp3+T细胞与细胞与CD4+CD25+Foxp3+T细

8、胞表面表达的分子及分泌的细胞因子有何不同，细胞表面表达的分子及分泌的细胞因子有何不同，及及 CD4+CD25-Foxp3+T细胞细胞有否抑制。有否抑制。检测检测22例新发例新发SLE 患者。用流式细胞仪分析比较患者。用流式细胞仪分析比较CD4+CD25-Foxp3+细细胞与胞与CD4+CD25+Foxp3+T细胞表面标志子表达及细胞因子表达的差异。细胞表面标志子表达及细胞因子表达的差异。检测检测CD4+CD25+Foxp3+T细胞对细胞对T细胞增殖有否调节作用。细胞增殖有否调节作用。新发新发SLE患者其它免疫细胞有什么特患者其它免疫细胞有什么特点点 新发其它自身免疫病免疫细胞有什么新发其它自身

9、免疫病免疫细胞有什么特点特点 新发其它自身免疫病新发其它自身免疫病其它免疫学指标其它免疫学指标有什么特点有什么特点从案例一能得到的启发从案例一能得到的启发案例二案例二新型抗流感药新型抗流感药DAS181的研发的研发A型流感病毒的生活周期型流感病毒的生活周期已批准上市的抗流感药物已批准上市的抗流感药物 M2离子通道阻滞剂离子通道阻滞剂 盐酸金刚乙胺（盐酸金刚乙胺（1993年美国年美国FDA批准上市）批准上市）金刚烷胺（金刚烷胺（1966 FDA年批准为预防药，年批准为预防药，1976年确认其为治疗药）年确认其为治疗药）神经胺酸酶（神经胺酸酶（NA）抑制剂）抑制剂 达菲（达菲（1999年美国年美国

10、FDA批准上市）批准上市）扎那米韦（扎那米韦（1999年年5月首先在澳大利亚获准上市）月首先在澳大利亚获准上市）除了毒副作用外，除了毒副作用外，主要的问题是流感病毒产生抗药性，主要的问题是流感病毒产生抗药性，因为病毒基因突变因为病毒基因突变研发中的抗流感药物研发中的抗流感药物流感病毒的流感病毒的NA与与HA相互作用相互作用感染靶细胞感染靶细胞 Neu5Ac (2,3)-Gal与与Neu5Ac (2,6)-Gal分子就分子就是流感病毒的受体。人流感病毒主要识别是流感病毒的受体。人流感病毒主要识别(2,6)-Gal唾液酸，禽唾液酸，禽流感病毒与马流感病毒主要识别流感病毒与马流感病毒主要识别(2,3

11、)-Gal唾液酸。流感病毒的唾液酸。流感病毒的HA与细胞表面含与细胞表面含(2,3)-Gal或或/和和(2,6)-Gal唾液酸的糖蛋白相结合。唾液酸的糖蛋白相结合。人人呼吸道上皮细胞的唾液酸主要是呼吸道上皮细胞的唾液酸主要是(2,6)-Gal型，但也型，但也有有(2,3)-Gal型，所以型，所以禽禽流感病毒也能感染人，尽管感流感病毒也能感染人，尽管感染效率不高。染效率不高。NA的作用是破坏的作用是破坏HA的受体。它酶切的受体。它酶切呼吸道黏膜上诸如呼吸道黏膜上诸如mucin等潜在抑制性分子的唾等潜在抑制性分子的唾液酸，从而使之灭活，促进病毒在呼吸道传播液酸，从而使之灭活，促进病毒在呼吸道传播;

12、酶切病毒感染细胞表面的唾液酸，促进子代病毒酶切病毒感染细胞表面的唾液酸，促进子代病毒释出，以助于病毒传播。释出，以助于病毒传播。HA的受体结合作用和的受体结合作用和NA的受体破坏作用相互相成，维持平衡，于病的受体破坏作用相互相成，维持平衡，于病毒复制和传播十分重要。毒复制和传播十分重要。呼吸道上皮细胞呼吸道上皮细胞唾液酸唾液酸流感病毒流感病毒 HANA 以往有报道，以往有报道，体外实验中唾液体外实验中唾液酸酶能有效阻止酸酶能有效阻止流感病毒感染细流感病毒感染细胞。胞。因此学者欲因此学者欲研制一种融合蛋研制一种融合蛋白，由唾液酸酶白，由唾液酸酶与能锚定于人呼与能锚定于人呼吸道上皮细胞的吸道上皮细

13、胞的蛋白组成蛋白组成。DAS181的分子模式的分子模式 报道已从微生物和真核细胞分离出报道已从微生物和真核细胞分离出15种底种底物特异性和酶动力学各异的唾液酸酶。从中物特异性和酶动力学各异的唾液酸酶。从中选择选择A.viscosus唾液酸酶的催化功能域。其理唾液酸酶的催化功能域。其理由为：底物特异性广；催化活性最大；人免由为：底物特异性广；催化活性最大；人免疫系统对其耐受，因为人正常口腔和胃肠道疫系统对其耐受，因为人正常口腔和胃肠道细菌也产生此唾液酸酶。细菌也产生此唾液酸酶。DAS181抗流感病毒作用的研究（细胞、抗流感病毒作用的研究（细胞、小鼠与雪貂模型）小鼠与雪貂模型）DAS181的创新点

14、的创新点 靶点在宿主细胞上，能避免产生病毒耐药靶点在宿主细胞上，能避免产生病毒耐药 广谱抗流感病毒药物（广谱抗流感病毒药物（A,B型流感、流感病毒耐药株、型流感、流感病毒耐药株、副流感病毒）副流感病毒）能酶切能酶切SA 2,3Gal和和SA 2,6Gal，也能酶切，也能酶切SA 2,8Gal。因此，对现有流感毒株、未来毒株、及重。因此，对现有流感毒株、未来毒株、及重组变异毒株均有效组变异毒株均有效 吸入给药，生物利用度高吸入给药，生物利用度高 药物作用持续时间较长：至少药物作用持续时间较长：至少2 2天（天（MDCK),),至少至少7 7天天（HAE)，用于预防和治疗均可，用于预防和治疗均可案

15、例三：与案例三：与IgA肾病发病机制相关肾病发病机制相关聚糖聚糖（glycan)核酸、蛋白质、聚糖和脂是所有细胞的核酸、蛋白质、聚糖和脂是所有细胞的4 4种基本大分子种基本大分子 核酸链基本上由核酸链基本上由4 4种核苷酸组成种核苷酸组成 肽链基本上由肽链基本上由2323种氨基酸组成种氨基酸组成 糖链十分复杂糖链十分复杂 脂质按生物学功能可分为三类：脂质按生物学功能可分为三类：储存脂质（包括甘油三脂和蜡）储存脂质（包括甘油三脂和蜡）结构脂质（构成生物膜脂双层的磷脂）结构脂质（构成生物膜脂双层的磷脂）活性脂质（类固醇和萜）活性脂质（类固醇和萜）案例四：几个病案分析及其它案例四：几个病案分析及其它

16、XXX等（等（301301医院）：不明原因发热的病因分布及临床特征医院）：不明原因发热的病因分布及临床特征 20002000年年1 1月至月至20092009年年1 1月在月在301301医院内科住院且符合不明原因发热的患者医院内科住院且符合不明原因发热的患者816816例，病因分布，例，病因分布，临床特征，老年患者与非老年患者之间的比较。临床特征，老年患者与非老年患者之间的比较。XXX等（北京协和医院）：结石性急性胆管炎的治疗等（北京协和医院）：结石性急性胆管炎的治疗 急诊的急诊的急性胆管炎患急性胆管炎患者者426426例，随着介入技术（急性行经皮经肝胆道穿刺引流术）和内镜技术例，随着介入技

17、术（急性行经皮经肝胆道穿刺引流术）和内镜技术（急性行经内镜逆行胰胆管造影）的进展，（急性行经内镜逆行胰胆管造影）的进展，急性胆管炎患者由急性胆管炎患者由急诊手术经保急诊手术经保守治疗或介入治疗转为择期手术，可以大大减少手术并发症发生率，降低手守治疗或介入治疗转为择期手术，可以大大减少手术并发症发生率，降低手术死亡率。术死亡率。XXX等（北京协和医院）：胰腺实性假乳头状瘤的等（北京协和医院）：胰腺实性假乳头状瘤的CTCT诊断及鉴别诊断诊断及鉴别诊断 对对1414例病理确诊的胰腺实性假乳头状瘤患者的例病理确诊的胰腺实性假乳头状瘤患者的CT资料作资料作CT诊断及鉴别诊断诊断及鉴别诊断(无功能性胰岛细

18、胞瘤、胰腺囊腺瘤、胰腺癌、胰腺假性囊肿无功能性胰岛细胞瘤、胰腺囊腺瘤、胰腺癌、胰腺假性囊肿）分析）分析XXX等（北京协和医院）：细针穿刺技术在乳腺癌手术治疗中的应用价值等（北京协和医院）：细针穿刺技术在乳腺癌手术治疗中的应用价值 北京协和医院初诊考虑乳腺癌可能性大的北京协和医院初诊考虑乳腺癌可能性大的530530例女性患者作例女性患者作细针穿刺细胞学细针穿刺细胞学（FNAC）检查。）检查。FNAC检查阳性检查阳性325例，直接行例，直接行乳腺癌根治术，乳腺癌根治术，术后组织术后组织病理学检查均为病理学检查均为乳腺癌。乳腺癌。FNAC检查阴性检查阴性205例，开放活检术，术后组织病例，开放活检术

19、，术后组织病理学检查理学检查137例例乳腺癌，乳腺癌，68例非例非乳腺癌。表明乳腺癌。表明FNAC有助于有助于对怀疑对怀疑乳腺癌者乳腺癌者选择适当的术式。选择适当的术式。以中国医学科学院学报以中国医学科学院学报20112011年第年第1 1期上的几篇论文为例期上的几篇论文为例病案分析加检验病案分析加检验科检测指标科检测指标也能也能发发SCISCI文章文章2009 确定确定“点点”，要有新意，要有新意 要有正常对照和其它对照（如阳性对照）要有正常对照和其它对照（如阳性对照）分析的指标不能单一，分析要有层次分析的指标不能单一，分析要有层次 正确的统计处理正确的统计处理 最好能结合一点实验室检测最好

20、能结合一点实验室检测病案分析中需注意的几点病案分析中需注意的几点药剂科的人员一般做药代动力学和生物效药剂科的人员一般做药代动力学和生物效性等的试验较多性等的试验较多对药剂师科研工作的建议对药剂师科研工作的建议 与临床大夫密切合作与临床大夫密切合作 参与新药研制参与新药研制 有效制剂的开发（如协和医院的健脑合剂等）有效制剂的开发（如协和医院的健脑合剂等）做一点药物作用机理的研究做一点药物作用机理的研究科研工作中尚需注意的几点科研工作中尚需注意的几点 每一步都要走得踏实，要核实试剂和仪器是否每一步都要走得踏实，要核实试剂和仪器是否OK（以（以本人做本人做PCR检测及研制检测及研制PSA试剂盒失败为

21、例说明）试剂盒失败为例说明）表位可分成两类：表位可分成两类：线性表位（线性表位（linear，指肽链上指肽链上由一段序列相连续的氨基酸残基所形成的抗原由一段序列相连续的氨基酸残基所形成的抗原表位表位）和构象表位（）和构象表位（conformation，指多肽或多指多肽或多糖链上由空间位置相邻，而序列上不相连续的糖链上由空间位置相邻，而序列上不相连续的氨基酸残基或多糖残基所形成的抗原表位氨基酸残基或多糖残基所形成的抗原表位）严格实验操作，做好实验记录严格实验操作，做好实验记录（包括病案记录）（包括病案记录）随时分析实验结果，适时对研究随时分析实验结果，适时对研究目的和技术路线作调整目的和技术路线

22、作调整爱因斯坦有关如何做爱因斯坦有关如何做科学研究的名言科学研究的名言One percent inspiration and ninety nine percent perspiration灵感来自哪里灵感来自哪里?临床实践与文献。要找到和明临床实践与文献。要找到和明确什么是你研究的确什么是你研究的“点点”（创新最关键创新最关键）。）。IdeaIdea DesignDesign(切实可行的技术路线切实可行的技术路线,从哪几方从哪几方面说明这个面说明这个“点点”，它们的逻辑顺序怎样），它们的逻辑顺序怎样）MethodsMethods。需要多一点分子生物学、免疫学、细胞生物学需要多一点分子生物学、

23、免疫学、细胞生物学等的知识，需多读文献。等的知识，需多读文献。如何写科研论文如何写科研论文 明确什么是这篇论文的明确什么是这篇论文的“点点”。确定论文的题目。确定论文的题目。画制图表（论文的画制图表（论文的核心核心）材料与方法材料与方法 查阅文献查阅文献 引言（包括问题的提出（背景、假设），回答了什么引言（包括问题的提出（背景、假设），回答了什么问题，创新点）问题，创新点）讨论（简单小结本研究的发现，与其他学者研究的比讨论（简单小结本研究的发现，与其他学者研究的比较，本创新发现的意义，其它，等等）较，本创新发现的意义，其它，等等）摘要摘要Clinical significance of inc

24、reased CD4+CD25-Foxp3+T cells in patients with new-onset systemic lupus erythematosus题题 目目以前述案例一（以前述案例一（2）为例）为例实验结果（图表的制作）实验结果（图表的制作）Fig 1.CD4+CD25+Foxp3+and CD4+CD25-Foxp3+T cells in SLE patients and normal controls Fig 2.The expression of CD127 by CD4+T cell subpopulation材料与方法材料与方法（可以参考他人的文章）（可以参考

25、他人的文章）前言前言 CD4+CD25+调节性调节性T细细胞在胞在SLE发病中作用的的发病中作用的的报道不甚一致，且尚无在报道不甚一致，且尚无在新发新发SLE患者研究的报道患者研究的报道 Foxp3表达不只限于表达不只限于CD4+CD25+T细胞细胞（Treg），作者以往研究），作者以往研究观察到观察到新发新发SLESLE患者患者CD4+CD25-Foxp3 T细胞细胞频率增高频率增高 CD4+CD25-Foxp3+T细胞有什么临床意义细胞有什么临床意义（包括问题的提出（背景、假设），回答（包括问题的提出（背景、假设），回答了什么问题，创新点）了什么问题，创新点）讨讨 论论有关有关CD4+CD

26、25+Treg细胞在细胞在SLE患者周患者周围血中状况的报道不尽相同。这可能与各围血中状况的报道不尽相同。这可能与各种免疫抑制剂使用相关。种免疫抑制剂使用相关。本文报道了在新发本文报道了在新发SLESLE所做的研究。对所做的研究。对CD4+CD25-Foxp3+T细胞作了讨论。与细胞作了讨论。与CD127表达的关系。表达的关系。新发新发SLESLE患者的患者的 CD4+CD25-Foxp3+T细细胞有一定临床意义。胞有一定临床意义。新发新发SLESLE患者的患者的 CD4+CD25-Foxp3+T细细胞有否抑制作用？胞有否抑制作用？（简单小结本研究的发现，与其他学（简单小结本研究的发现，与其他学者研究的比较，本创新发现的意义，者研究的比较，本创新发现的意义，其它，等等）其它，等等）如如果果自自己己用用英英语语写写论论文文暂暂时时有有困困难难，可可请请专专门门的的论论文文写写作作公公司司帮帮忙忙。关关键键是是要要有有创创新新的的研研究究结结果果和和确确切切可可靠靠的的数据。数据。中文论文也一样中文论文也一样基金申请基金申请申请书的撰写（立论依据、技术路线、申请书的撰写（立论依据、技术路线、拟使用的方法、创新点、工作基础、拟使用的方法、创新点、工作基础、队伍）队伍）评审的流程评审的流程谢谢 谢谢!