细胞融合概述.ppt

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1、细胞融合概述 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望细胞融合（细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交（somatic hybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融合形成单个细胞的过程。一、细胞融合的定义一、细胞融合的定义uMuller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。uVirchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。uLuginbuhl于1873年

2、观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。uLange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。uCienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。u1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。u1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。u1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。u20世纪80年代出现了电融合技术。二、细胞融合研究进展二、细胞融合研究进展生物种类生物种类生物

3、种类生物种类细胞来源细胞来源细胞来源细胞来源成功年代成功年代成功年代成功年代烟草两个种间烟草两个种间苷蓝苷蓝青菜青菜大豆大豆马唐草马唐草矮牵牛矮牵牛龙面花龙面花大麦大麦花生花生大麦大麦大豆大豆小麦小麦矮牵牛矮牵牛油菜油菜大豆大豆玉米玉米大豆大豆大豆大豆野豌豆野豌豆大麦大麦蚕豆蚕豆大豆大豆草香木犀草香木犀酵母菌酵母菌鸡鸡大豆大豆烟草烟草大豆大豆秋水仙秋水仙人人胡萝卜胡萝卜番茄番茄马铃薯马铃薯人人小鼠小鼠叶叶叶叶叶叶根根愈伤组织愈伤组织叶叶叶叶花瓣花瓣种子种子种子种子叶叶悬浮细胞悬浮细胞叶叶花瓣花瓣叶叶悬浮细胞悬浮细胞叶叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶叶根根悬浮细胞悬浮细胞叶叶

4、原生质体原生质体血红细胞血红细胞悬浮细胞悬浮细胞叶叶悬浮细胞悬浮细胞叶叶腹水癌细胞腹水癌细胞原生质体原生质体叶叶根尖根尖纤维肉瘤细胞纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞畸胎瘤细胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972几种细胞融合成功的例子几种细胞融合成功的例子植物融合细胞成长状态对比植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合的右瓶为地面融合的细胞，左瓶中为太空微重

5、力环境下融合的细胞细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞 动物细胞融合实验使用的小白鼠 三、动植物细胞的融合过程三、动植物细胞的融合过程植物细胞融合过程植物细胞融合过程人造小鼠培育过程示意图人造小鼠培育过程示意图四、细胞融合的意义四、细胞融合的意义u理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这 对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。u融合过程融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间，为远缘物种间 的遗传物质交换

6、提供了有效途径。的遗传物质交换提供了有效途径。u体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分 裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新亦可发生重组，从而产生新 的核外遗传系统。的核外遗传系统。u淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。细胞融合的基本原理细胞融合的基本原理显微镜下细胞融合过程显微镜下细胞融合过程融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解用灭

7、活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 细胞融合的常用方法细胞融合的常用方法一、仙台病毒法一、仙台病毒法仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：两种细胞在一起培养，加入病毒，在4条件下病毒附着在细胞 膜上。并使两细胞相互凝聚；在37中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需 要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2；细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；融合成巨大细胞，仍需ATP。病毒促使细胞融合的主要步骤如下：病毒促使细胞融合的主要步骤如下：1.两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；2.通过病

8、毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；3.两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；4.进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 u 优点是易得，用法简单，融合效果稳定。u聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂。uPEG浓度以W/W；如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合（假定1ml培养液为1g重)，即成50PEG溶液。uPEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。u通常用分子量低

9、于1000的PEG作融合剂最好，50PEG溶液能产生最多杂交细胞。uPEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。二、聚乙二醇（二、聚乙二醇（PEG）法）法聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程）法细胞融合过程PEG的作用机理的作用机理：Kao等认为，由于等认为，由于PEG分子分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增

10、加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。器发生融合成为可能。PEG诱导融合的特点诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。可能对细胞有毒害。聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法）法细胞融合步骤细胞融合步骤（1）将两种不同亲本细胞各5l06混匀；（2）离心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟；（4）加9

11、ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养 液至 5ml，37的CO2培养箱中培养。（6）624小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。三、电融合法三、电融合法 电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。电融合法的优点：电融合法的优点：u融合率高、重复性强、对细胞伤害小；u装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；u免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。电融合的基本过程：电融合的基

12、本过程：细胞膜的接触：细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿：膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。电融合诱导法原理示意图电

13、融合诱导法原理示意图杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选n原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。n1）亲本 n2）同核体：同源原生质体的融合体n3）异核体：非同源的原生质体的融合体n4）多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体n5）异胞质体：具有不同胞质来源的杂合细胞。n6）核质体：有细胞核而带有少量细胞质的亚原生质体u基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选u基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选u由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选u具有所需性状杂种细胞的筛选常用的杂种细胞筛选方法常用的杂种细胞筛选方法植物细胞筛选方式1）遗传互

14、补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。n 如亲本1：叶绿体缺陷型 亲本2：光致死型 两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白 色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长n2）抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。n如：n亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基上不能超过50个世代n亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上生长n杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长，而亲本和其它细胞死亡3）利用物理特性筛选法：根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。亲本1：用

15、异硫氰酸荧光素染色原生质体 亲本2：叶肉细胞原生质体 在荧光显微镜下，亲本1为红色，亲本2为绿色，杂种细胞可以区分n4）利用生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。n例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长，但其融合细胞可以产生内源激素，在培养基上不需加激素。动物细胞的筛选方式：n1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。n亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感n亲本B：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感n杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长n2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养

16、缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。n亲本A：色氨酸缺陷型n亲本B：苏氨酸缺陷型n杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。n3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。n亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。n亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。n杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长。1杂种细胞的遗传特性和应用杂种细胞的遗传特性和应用2杂种细胞在细胞生物学研究杂种细胞在细胞生物学研究中的应用中的应用3杂种细胞在植物育种中的

17、应用杂种细胞在植物育种中的应用1 1 杂种细胞在细胞生物学研究中的应用杂种细胞在细胞生物学研究中的应用n1 1）基因定位基因定位 不同种属的细胞融合时，常会出现一个亲本细不同种属的细胞融合时，常会出现一个亲本细胞的染色体被优先排除，而另一个亲本的染色胞的染色体被优先排除，而另一个亲本的染色体被选择性留下，即体被选择性留下，即染色体分离染色体分离的现象。由此，的现象。由此，可根据表型和与表型特征相对应的基因在特定可根据表型和与表型特征相对应的基因在特定染色体上。染色体上。例如例如 ：HGPRTHGPRT人细胞与人细胞与TKTK的小鼠细胞融合的小鼠细胞融合后，可用后，可用HATHAT培养基分离得到

18、一种仅含一条人培养基分离得到一种仅含一条人E E组染色体的杂种细胞，具有组染色体的杂种细胞，具有TKTK活性，由此得到活性，由此得到人的人的TKTK基因是在基因是在E E组染色体上的。组染色体上的。n n2 2）体细胞杂种的致瘤性分析体细胞杂种的致瘤性分析 通过正常二倍体细胞和致瘤性或病毒转化通过正常二倍体细胞和致瘤性或病毒转化细胞的融合来进行致瘤性的遗传分析。细胞的融合来进行致瘤性的遗传分析。n n3 3）遗传缺陷的基因互补遗传缺陷的基因互补 基于杂种细胞的基因互补作用，可分为基基于杂种细胞的基因互补作用，可分为基因间和基因内的互补作用，即杂种细胞可因间和基因内的互补作用，即杂种细胞可以具有

19、两种亲本在遗传上缺陷的基因表型。以具有两种亲本在遗传上缺陷的基因表型。通过这种基因互补，可以用正常基因来治通过这种基因互补，可以用正常基因来治疗由于基因突变或基因缺失的疾病。疗由于基因突变或基因缺失的疾病。n n4 4）分化功能表达调控的研究分化功能表达调控的研究n n通过细胞融合可将不同分化状态或组通过细胞融合可将不同分化状态或组织类型的细胞构建成为能够存活的种织类型的细胞构建成为能够存活的种内或种间杂种，同时对杂种细胞内的内或种间杂种，同时对杂种细胞内的基因组和胞质观察和分析，了解如何基因组和胞质观察和分析，了解如何通过相互作用而最终导致原先表达的通过相互作用而最终导致原先表达的分化性状熄

20、灭或保留。分化性状熄灭或保留。2 2杂种细胞在植物杂种细胞在植物育种中的应用育种中的应用n n杂种细胞杂种细胞杂种细胞杂种细胞是一条是一条是一条是一条新的育种途新的育种途新的育种途新的育种途径径径径，可以产生新经济性状的，可以产生新经济性状的，可以产生新经济性状的，可以产生新经济性状的良种。良种。良种。良种。n n科学家已经在禾本科、茄科、科学家已经在禾本科、茄科、科学家已经在禾本科、茄科、科学家已经在禾本科、茄科、豆科、十字花科等植物中得豆科、十字花科等植物中得豆科、十字花科等植物中得豆科、十字花科等植物中得到了杂种再生植株。到了杂种再生植株。到了杂种再生植株。到了杂种再生植株。n n一些近

21、亲植物、有性不亲和一些近亲植物、有性不亲和一些近亲植物、有性不亲和一些近亲植物、有性不亲和的组合，如马铃薯的组合，如马铃薯的组合，如马铃薯的组合，如马铃薯 番茄等都番茄等都番茄等都番茄等都得到了再生植株。得到了再生植株。得到了再生植株。得到了再生植株。n n目标：地上和地下部兼用种、目标：地上和地下部兼用种、目标：地上和地下部兼用种、目标：地上和地下部兼用种、固氮禾等固氮禾等固氮禾等固氮禾等具有两种不同优势具有两种不同优势具有两种不同优势具有两种不同优势性状的新品种性状的新品种性状的新品种性状的新品种。3、细胞融合技术、细胞融合技术 在食品工业中的应用在食品工业中的应用n（1）酵母菌的育种）酵

22、母菌的育种n（2）氨基酸生产菌的育种）氨基酸生产菌的育种n（3）酶制剂生产菌株的育种）酶制剂生产菌株的育种思考：n1、植物杂种细胞筛选有哪些方法？n2、动物杂种细胞筛选有哪些方法？n3、促进细胞融合的方法有哪些，各自的优缺点及应用。细胞杂交瘤技术细胞杂交瘤技术 与单克隆抗体与单克隆抗体一、何谓单克隆抗体？一、何谓单克隆抗体？只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体单克隆抗体。单克隆抗体技术的核心是用单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞(myeloma cell)与与经特定抗源免疫刺激的经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞淋巴细胞(antigen stim

23、ulated B lymphoblast)融合得到融合得到杂交瘤细胞杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术交瘤技术(hybridoma technology）。）。Niels K.Jerne G.Kohler C.Milstein 二、杂交瘤技术的基本原理二、杂交瘤技术的基本原理三、杂交瘤细胞的制备三、杂交瘤细胞的制备（一）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基（一）骨

24、髓瘤细胞选择及选择性培养基骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）HAT培养基培养基次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T）次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）（二）免疫小鼠（二）免疫小鼠 免疫程序是取68周龄BalbC雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强免疫

25、一次，35天后用于融合。免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为loog，第二次为50g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1l06一1107。（三）脾细胞的制备（三）脾细胞的制备(1)(1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；(2)(2)无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml5ml无血清培养液冲洗一次；无血清培养液冲洗一次；(3)(3)把脾脏置于已消毒的把脾脏置于已消毒的9090一一10

26、0100目不锈钢网或尼龙纱网中；目不锈钢网或尼龙纱网中；(4)(4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3ml3ml无血清培养无血清培养 液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可；液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可；(5)(5)把细胞悬液注入把细胞悬液注入50ml50ml离心管中，加离心管中，加l0l0一一20ml20ml培养液：轻轻吹打数次，室温中培养液：轻轻吹打数次，

27、室温中 置置5 5分钟；分钟；(6)(6)离心离心(800(800一一10001000转分转分)计数、备用。计数、备用。（四）细胞准备（四）细胞准备（1 1）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3 3次次(37)(37)，计数活力细胞，计数活力细胞(不少于不少于9090)；（2 2）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗3 3次次(37)(37)，并计细胞数和测定活力细胞；，并计细胞数和测定活力细胞；（3 3）按）按1 1：5 5或或1 1：1010混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清

28、，并以消毒滤 纸吸纸吸 净多余上清。净多余上清。（五）细胞融合（五）细胞融合(1)将1ml 40的PEG液一滴滴加入列细胞团中，在60秒内加完，同时并不断轻微 转动离心管或用手指轻弹离心管；(2)在不断转动离心管中加1ml无血清培养液，60秒钟内加完；(3)于5分钟内慢慢加完20ml无血清培养液；此时细胞对机械损伤非常敏感，(4)离心(800转分，8分钟)，去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀；(5)取96孔板，每孔加50l；(6)取等体积细胞悬液，向另一96孔板中加50P1；(7)送入5CO2，温箱中37培养，24小时后更换成HAT选择性培养掖。（六）融合后细胞培养（六）融合后细胞培养

29、(1)融合后710天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加一半新的)后每隔23天 半量换液一次；(2)两周后可改用HA培养液半量换液，或仍用HAT培养液；(3)23周后出现杂交细胞集落，细胞个大、圆且透明；(4)待集落增殖生长至13孔时，应进行抗体检测。HAT培养基培养基次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T）次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）本章小结本章小结u细胞融合又称体细胞杂交，是两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融 合形成单个细胞的过程。u细胞融合的方法主要有生物法（仙台病毒法）、化学法（聚乙二醇 法）和物理法（电融合法）。u杂合细胞的筛选方法主要有基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂 种筛选、基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选、由温度敏感型细胞 组成的杂种细胞的筛选及具有所需性状杂种细胞的筛选。u基于细胞融合的杂交瘤技术和单克隆抗体技术具有广泛的应用价值。