细胞融合课件.ppt

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1、关于细胞融合现在学习的是第1页，共78页 又称又称体细胞杂交体细胞杂交(Somatic hybridization)(Somatic hybridization)是指将不同来源的原生质体（细胞）相融合并是指将不同来源的原生质体（细胞）相融合并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。现在学习的是第2页，共78页现在学习的是第3页，共78页l 人们很早就发现在生物界中有自发的细胞融合现象。我们知人们很早就发现在生物界中有自发的细胞融合现象。我们知道，无论是远缘杂交还是利用多倍体技术都要先实现有性杂交，道，无论是远缘杂交还是利用多倍体技术都要先实现有性杂交，而

2、而亲缘关系较远的物种间杂交往往表现为亲缘关系较远的物种间杂交往往表现为杂交不亲合杂交不亲合或或不能受不能受精精或是胚胎早期败育。或是胚胎早期败育。l克服远缘杂交中的不亲和障碍；克服远缘杂交中的不亲和障碍；l优良性状改良优良性状改良l组合起各种植物的优良遗传性状，从而组合起各种植物的优良遗传性状，从而培育出理想的新品种。培育出理想的新品种。现在学习的是第4页，共78页l 进行体细胞融合就可以避开生殖细胞的受精过程。进行体细胞融合就可以避开生殖细胞的受精过程。避免上述种种麻烦，从而在亲缘更远的物种间避免上述种种麻烦，从而在亲缘更远的物种间实现基因转移，创造出自然界中所没有的新物实现基因转移，创造出

3、自然界中所没有的新物种。种。l 例如，马铃薯和番茄通过细胞融合得例如，马铃薯和番茄通过细胞融合得到了至今有性杂交未能获得的到了至今有性杂交未能获得的属间杂种属间杂种薯番茄薯番茄和和番茄薯。番茄薯。现在学习的是第5页，共78页l 许多研究人员成功地进行了不同植物许多研究人员成功地进行了不同植物的细胞融合，并培养出了再生植株后，许的细胞融合，并培养出了再生植株后，许多人开始尝试培育不同种属的超级杂交植多人开始尝试培育不同种属的超级杂交植物。年，德国的梅罗帕斯博士用物。年，德国的梅罗帕斯博士用细胞融合的方法细胞融合的方法培育出了马铃薯（土豆）和培育出了马铃薯（土豆）和番茄的杂交后代番茄的杂交后代薯番

4、茄薯番茄。他们先用酶。他们先用酶液除去马铃薯、番茄的细胞壁，然后将两种液除去马铃薯、番茄的细胞壁，然后将两种去壁细胞（原生质体）等量混合，在混合液去壁细胞（原生质体）等量混合，在混合液中加进中加进聚乙二醇溶液聚乙二醇溶液，使原生质体紧密，使原生质体紧密粘聚，再用高钙和高溶液处理，结果，粘聚，再用高钙和高溶液处理，结果，马铃薯与番茄两种原生质体的融合率竟高马铃薯与番茄两种原生质体的融合率竟高达。达。其中所育成的其中所育成的“番茄番茄薯薯”新品种地上部分能结番茄，地下部分能新品种地上部分能结番茄，地下部分能结马铃薯结马铃薯现在学习的是第6页，共78页l 存在问题存在问题l （1 1）通过融合将双亲

5、的染色体组相加，往往通过融合将双亲的染色体组相加，往往会造成遗传上的不稳定，杂种细胞也不易分化会造成遗传上的不稳定，杂种细胞也不易分化成株。成株。l (2)(2)从野生种带进过多的不良基因从野生种带进过多的不良基因现在学习的是第7页，共78页l1、对于植物细胞而言，一般先对于植物细胞而言，一般先得到原生质体得到原生质体l2 2、通过物理或化学方法、通过物理或化学方法诱导细胞融合诱导细胞融合形成杂种细胞形成杂种细胞l3 3、进行杂种细胞的、进行杂种细胞的分检和培养分检和培养l4 4、促使杂种细胞分裂、促使杂种细胞分裂形成细胞团、愈伤组织形成细胞团、愈伤组织、直至形成、直至形成杂种杂种植株植株，从

6、而实现基因在远缘物种间的转移，从而实现基因在远缘物种间的转移l 由于这个新细胞得到了由于这个新细胞得到了来自两个细胞的染色体组和细胞质，来自两个细胞的染色体组和细胞质，在在适宜的条件下来培养，长成的生物个体就是一个适宜的条件下来培养，长成的生物个体就是一个新的物种或品新的物种或品系系。现在学习的是第8页，共78页l53 基本原理基本原理l 新新生生物物现在学习的是第9页，共78页l 细胞可以发生融合的生物范围是很广的。到细胞可以发生融合的生物范围是很广的。到目前为止、已经在种间、属间、科间以及动植目前为止、已经在种间、属间、科间以及动植物两界之间都做过细胞融合的尝试，但物两界之间都做过细胞融合

7、的尝试，但只有体只有体细胞的无性杂交才是真正意义上的细胞融合技细胞的无性杂交才是真正意义上的细胞融合技术术。现在学习的是第10页，共78页现在学习的是第11页，共78页融 合 过 程现在学习的是第12页，共78页l 细胞融合主要经过了以下细胞融合主要经过了以下4 4步：步：l两原生质体或细胞互相靠近两原生质体或细胞互相靠近l细胞桥形成细胞桥形成l胞质渗透胞质渗透l细胞核融合细胞核融合l其中其中细胞桥的形成细胞桥的形成是细胞融合最关键的一是细胞融合最关键的一步步现在学习的是第13页，共78页l5 54 41 1 植物或微生物原生质体的制备植物或微生物原生质体的制备l 植物和许多微生物细胞外有一层

8、坚韧的细胞壁，为了植物和许多微生物细胞外有一层坚韧的细胞壁，为了促使这样细胞的融合就必须先得到单个细胞，促使这样细胞的融合就必须先得到单个细胞，除去细胞壁除去细胞壁，才能获得植物原生质体或微生物原生质球才能获得植物原生质体或微生物原生质球 。因此时于。因此时于植物和微生物细胞的融合一般又可称为原生质体融合。植物和微生物细胞的融合一般又可称为原生质体融合。l 现在学习的是第14页，共78页l 5 54 42 2 动物单个细胞的获得动物单个细胞的获得l （一）组织的获得（一）组织的获得l (二二)组织的消化组织的消化l 现在学习的是第15页，共78页l 现在学习的是第16页，共78页l l物理法物

9、理法 主要包括显微操作、电场刺激等；主要包括显微操作、电场刺激等；l化学法化学法 主要是用聚乙二醇主要是用聚乙二醇PEGPEG结合高结合高PHPH、高钙离子法；高钙离子法；l生物法生物法 有仙台病毒法等。有仙台病毒法等。现在学习的是第17页，共78页l 具体应用时要根据不同对象选择不同的具体应用时要根据不同对象选择不同的细胞融合方法和条件。细胞融合方法和条件。l 诱导动物细胞融合诱导动物细胞融合 仙台病毒仙台病毒HVJHVJ诱导、诱导、PEGPEG法、电融合法都适用法、电融合法都适用l 植物细胞融合植物细胞融合 常用常用PEGPEG法和电融合法；法和电融合法；l 微生物细胞融合微生物细胞融合

10、只适用只适用PEGPEG法法现在学习的是第18页，共78页l 我们知道很多病毒都具有我们知道很多病毒都具有凝集细胞凝集细胞的能力。的能力。它一边黏接在一个细胞表面，另外一边黏接它一边黏接在一个细胞表面，另外一边黏接在另一个细胞表面，从而使两个细胞在病毒在另一个细胞表面，从而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。的作用下靠近发生凝结。l 仙台病毒仙台病毒也称也称日本血凝病毒日本血凝病毒HVJ,HVJ,属黏液属黏液病毒副流感类群，是病毒副流感类群，是RNARNA病毒，多型颗粒状，病毒，多型颗粒状，易在小鼠中蔓延。易在小鼠中蔓延。现在学习的是第19页，共78页l 由于被感染细胞表面发生某些改变，使由

11、于被感染细胞表面发生某些改变，使得这些细胞容易发生融合，得这些细胞容易发生融合，甚至处死的甚至处死的HVJHVJ病毒也具有促进细胞融合的作用。病毒也具有促进细胞融合的作用。l 日本学者冈田利用仙台病毒使两种不同日本学者冈田利用仙台病毒使两种不同的动物细胞之间发生凝集，进而融合成一体。的动物细胞之间发生凝集，进而融合成一体。现在学习的是第20页，共78页l 研究发现：研究发现：促进细胞融合的有效部位在于促进细胞融合的有效部位在于病毒的病毒的膜膜，被超声波打碎的病毒膜片仍具有，被超声波打碎的病毒膜片仍具有促进细胞融合的功能。促进细胞融合的功能。l 仙台病毒促使细胞融合的因素与病毒被膜仙台病毒促使细

12、胞融合的因素与病毒被膜上的磷脂成分有关，而与病毒内核酸的活性上的磷脂成分有关，而与病毒内核酸的活性无关。无关。l 仙台病毒被膜糖蛋白仙台病毒被膜糖蛋白与其促融合的能力有与其促融合的能力有关。在动物细胞融合中，关。在动物细胞融合中，仙台病毒仙台病毒(HVJ)(HVJ)已成已成为产生细胞杂种的标准融合剂。为产生细胞杂种的标准融合剂。现在学习的是第21页，共78页l 病毒促使细胞融合的主要步骤：病毒促使细胞融合的主要步骤：l (1)(1)两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近此靠近l (2)(2)通过病毒与原生质体或细胞膜的作用是两个通过病毒与原生质体或细胞膜

13、的作用是两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透l (3)(3)两个原生质体的细胞核互相融合，融为两个原生质体的细胞核互相融合，融为一体一体l (4)(4)进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种子细胞。两种染色体的杂种子细胞。现在学习的是第22页，共78页用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核细胞核病毒颗粒病毒颗粒细胞核细胞核现在学习的是第23页，共78页l 现在学习的是第24页，共78页l细胞融合中的化学法诱导主要包括：细胞融合中的化学法诱导主要包括：lNaNONaNO3 3诱导诱导 NaN

14、ONaNO3 3能中和原生质体表面负电荷，促进原生能中和原生质体表面负电荷，促进原生质体聚集，对原生质体无损害，但融合效率低质体聚集，对原生质体无损害，但融合效率低。l高高CaCa2+2+和和pHpH诱导法诱导法lPEGPEG诱导诱导lPEGPEG结合高结合高CaCa2+2+和和PHPH诱导法诱导法l上面几种方法中以上面几种方法中以PEGPEG结合高结合高CaCa2+2+和和PHPH诱导法诱导法最为常用，下最为常用，下面做重点介绍：面做重点介绍：现在学习的是第25页，共78页l5 55 52 21 1 基本原理基本原理l 聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)是一种多聚化合物，商品名卡波是一种多

15、聚化合物，商品名卡波蜡，实验室用的蜡，实验室用的PEG PEG，平均相对分子质量在，平均相对分子质量在200-2000200-2000之间，之间，一般一般10001000以下者为液体以下者为液体，10001000以上者为固体以上者为固体。l 1974 1974年人们用它诱导大麦、大豆植物原生质体年人们用它诱导大麦、大豆植物原生质体融合，以后又用融合，以后又用PEGPEG诱导与用高诱导与用高CaCa2+2+和和PHPH诱导相结诱导相结合，极大地提高了融合效率。合，极大地提高了融合效率。现在学习的是第26页，共78页l机制机制 l 由于由于PEGPEG分子带有大量负电荷，和原分子带有大量负电荷，和

16、原生质体表面的负电荷生质体表面的负电荷在钙离子的连接下在钙离子的连接下形成静电键形成静电键，从而在原生质体之间形成，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连分子桥，其结果是使原生质体发生粘连而促使原生质体的融合；另外，而促使原生质体的融合；另外，PEGPEG能增能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。细胞器发生融合成为可能。现在学习的是第27页，共78页l 用高用高CaCa2+2+和和PHPH溶液把与质膜结合的溶液把与质膜结合的PEGPEG分子进行洗脱，导致电荷平衡失调并重分子进行洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两

17、种原生质体上的正负电荷新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。合体。现在学习的是第28页，共78页现在学习的是第29页，共78页l一、一、基本原理基本原理l 开发较晚，但目前应用广泛。开发较晚，但目前应用广泛。l 电融合必须有电融合必须有融合仪和融合板融合仪和融合板。l原理：原理：在直流电脉冲的诱导下，在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的电原生质体质膜表面的电荷荷和和氧化还原电位氧化还原电位发生改变。使异种原生质体黏合并发生改变。使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，至到闭和成发生质膜瞬间破裂，进而质膜开

18、始连接，至到闭和成完整的膜形成融合体。完整的膜形成融合体。现在学习的是第30页，共78页l与与PEGPEG法比较，电融合法三大法比较，电融合法三大优点：优点：l 1 1、融合率高、重复性强、对原生质体伤害小；、融合率高、重复性强、对原生质体伤害小；l 2 2、装置精巧、方便简单、可在显微镜下观察或录像融、装置精巧、方便简单、可在显微镜下观察或录像融合过程；合过程；l 3 3、免去、免去PEG PEG 诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等等。强等等。现在学习的是第31页，共78页现在学习的是第32页，共78页l本产品是一台本产品是一台多功能的细胞多功能的细胞电

19、融合和电穿孔仪电融合和电穿孔仪，独特的，独特的交流非正弦波交流非正弦波 使细胞双向电使细胞双向电泳排列到一起，然后在微秒泳排列到一起，然后在微秒级时间内转换成直流方波使级时间内转换成直流方波使细胞融合，融合后的交流脉细胞融合，融合后的交流脉冲稳定杂合细胞的融合状态，冲稳定杂合细胞的融合状态，大大提高了细胞融合的效率。大大提高了细胞融合的效率。现在学习的是第33页，共78页l二、二、基本过程基本过程l 细胞膜的接触：细胞膜的接触：l 当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体电流即通过原生质体

20、而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串触排列成串l 膜的击穿：膜的击穿：l 原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起在一起现在学习的是第34页，共78页l 现在学习的是第35页，共78页l一、一、影响植物细胞融合的因素影响植物细胞融合的因素l 植物原生质体融合无种属特异性，植物原生质体融合无种属特异性，与其自身种属无关，与其自身种属无关，故故其

21、融合效率仅与外界条件有关。其融合效率仅与外界条件有关。l 1 1、PEGPEG诱导融合的关键是诱导融合的关键是作用时间作用时间，尤其是高，尤其是高CaCa2+2+和和PHPH溶液处理溶液处理时间长短非常重要。时间长短非常重要。l 时间过长，原生质体损伤严重，融合效率低时间过长，原生质体损伤严重，融合效率低l 过短则不融合。过短则不融合。l 2 2、PEG PEG规格和纯度规格和纯度与融合效率也有关系。与融合效率也有关系。l 现在学习的是第36页，共78页l l3 3、在电场诱导融合时，融合率与、在电场诱导融合时，融合率与原生质体密度原生质体密度有关，密度小有关，密度小于于10104 4个个/m

22、lml融合效率较低，大于融合效率较低，大于10106 6个个/mlml，会融合成团。会融合成团。l 最适宜的密度是最适宜的密度是2-8102-8104 4个个/mlml。l4 4、在融合液中加入、在融合液中加入少量少量CaCICaCI2 2,既可维持一定电导率，对细胞也既可维持一定电导率，对细胞也有保护作用。有保护作用。l 另外另外交变电流的强弱、处理时间长短、电脉冲大小交变电流的强弱、处理时间长短、电脉冲大小均会影均会影响融合率。响融合率。l 5 5、此外，用混合盐溶液对原生质进行融合前处理，以及、此外，用混合盐溶液对原生质进行融合前处理，以及在在促融剂中添加伴刀豆蛋白、二甲基亚砜促融剂中添

23、加伴刀豆蛋白、二甲基亚砜等可提高融合率。等可提高融合率。现在学习的是第37页，共78页l二、影响动物细胞融合的因素二、影响动物细胞融合的因素l 在动物细胞的融合过程中，除促融剂外在动物细胞的融合过程中，除促融剂外，细胞性质、，细胞性质、温度、温度、PHPH、离子强度、离子种类离子强度、离子种类均可影响细胞融合率。均可影响细胞融合率。l 1 1、亲本细胞表面性质亲本细胞表面性质影响较大，表面覆盖绒毛而不规则者影响较大，表面覆盖绒毛而不规则者容易融合，而表面光滑者较难融合。容易融合，而表面光滑者较难融合。l 2 2、细胞种类细胞种类不同，融合效果也不同，如：腹水癌较易不同，融合效果也不同，如：腹水

24、癌较易融合，而淋巴细胞、血细胞几乎不融合。融合，而淋巴细胞、血细胞几乎不融合。现在学习的是第38页，共78页l3 3、细胞融合时，需要适宜的、细胞融合时，需要适宜的温度和运动状态。温度和运动状态。l4 4、细胞融合过程中，通常、细胞融合过程中，通常耗氧量耗氧量大，缺氧时大，缺氧时不融合。不融合。l5 5、有些细胞融合时需要、有些细胞融合时需要CaCa2+2+否则不融合。否则不融合。l6 6、最适合的、最适合的PHPH为为7.4-7.87.4-7.8之间，在此范围之外，之间，在此范围之外，不宜融合。不宜融合。现在学习的是第39页，共78页l 不同的融合产物在培养条件下有着不同的命运。不同的融合产

25、物在培养条件下有着不同的命运。l 未融合的原生质体未融合的原生质体和和同源融合的原生质体同源融合的原生质体能较快地适能较快地适应培养条件而生长发育。应培养条件而生长发育。l 异源融合体异源融合体往往因它们发育缓慢而受到优势生长的亲本往往因它们发育缓慢而受到优势生长的亲本原生质体融合细胞的抑制，不易发育成杂种。原生质体融合细胞的抑制，不易发育成杂种。因此需要通因此需要通过培养和筛选，除去不需要的细胞，分离出需要的杂种过培养和筛选，除去不需要的细胞，分离出需要的杂种细胞，从而解决融合细胞的选择问题。细胞，从而解决融合细胞的选择问题。现在学习的是第40页，共78页l 对于如何筛选杂种细胞，尚无特定规

26、律对于如何筛选杂种细胞，尚无特定规律可循，需对不同对象设计具体的筛选方案可循，需对不同对象设计具体的筛选方案和选择体系，优先选择杂种细胞，或只允和选择体系，优先选择杂种细胞，或只允许杂种细胞生长，以淘汰亲本细胞。许杂种细胞生长，以淘汰亲本细胞。l5.6 融合细胞的选择融合细胞的选择现在学习的是第41页，共78页l 最简单的选择方法是利用最简单的选择方法是利用双亲细胞形态和色泽上的差异双亲细胞形态和色泽上的差异识识别杂种细胞，但多数是根据细胞生理遗传上的特性来选择。比较别杂种细胞，但多数是根据细胞生理遗传上的特性来选择。比较常用的杂种细胞筛选方法包括：常用的杂种细胞筛选方法包括：l (1)(1)

27、遗传互补筛选法：遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另外一亲本的缺陷，从而令杂种细胞表现正位基因，纠正另外一亲本的缺陷，从而令杂种细胞表现正常功能的原理选择杂种细胞常功能的原理选择杂种细胞。l如亲本如亲本1 1：叶绿体缺陷型：叶绿体缺陷型亲本亲本2 2：光致死型：光致死型两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白色，融合细胞长两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长成植株呈绿色，并能成长 现在学习的是第42页，共78页l (2)(2)抗体互补筛选法；抗体互补筛选法；利用亲本原生质体对利用亲本原生质体对抗生素、除草剂及其他

28、毒性物质抗生素、除草剂及其他毒性物质抗性差异抗性差异来选来选择杂种细胞。择杂种细胞。抗性突变体或抗药性有差异的抗性突变体或抗药性有差异的可可采用这种方法。采用这种方法。现在学习的是第43页，共78页l (3)(3)生长特性筛选法生长特性筛选法：利用原生质体对利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞选择杂种细胞。例如：亲本原生质体生长要求例如：亲本原生质体生长要求外源激素外源激素，而有，而有的杂种细胞由于双亲互补作用会产生内激素，的杂种细胞由于双亲互补作用会产生内激素，从而使杂种细胞能在无激素的培养基上生长。从而使杂种细胞能在无激素的培养基上生长。现在学习的

29、是第44页，共78页l(5)(5)其他方法：其他方法：采用显微操作技术也能把单采用显微操作技术也能把单个异核体分离出来进行培养。因为如果是融个异核体分离出来进行培养。因为如果是融合细胞，就必定具有与双亲本不同的荧光标合细胞，就必定具有与双亲本不同的荧光标记，所以科学家发明了一种普遍适用的方法，记，所以科学家发明了一种普遍适用的方法，即即采用无毒的荧光素标记双亲原生质体。融采用无毒的荧光素标记双亲原生质体。融合后利用一种电子荧光激活选择器自动分类合后利用一种电子荧光激活选择器自动分类和选择融合细胞。和选择融合细胞。l 以上方法中利用以上方法中利用选择性培养基选择性培养基是一个很是一个很常用的杂种

30、细胞选择方法。常用的杂种细胞选择方法。现在学习的是第45页，共78页l5 57 7 细胞融合技术的应用举例细胞融合技术的应用举例l 植物原生质体融合的研究已有植物原生质体融合的研究已有90 90 多年的历史。但现代植多年的历史。但现代植物细胞融合技术研究是从物细胞融合技术研究是从2020世纪世纪6060年代才开始的，年代才开始的，2020世纪世纪7070年年代，一些科学家探讨了植物细胞杂交的内容、方法和意义，并代，一些科学家探讨了植物细胞杂交的内容、方法和意义，并提出具有吸引力的以番茄和马铃薯为细胞杂交亲本的细胞杂交提出具有吸引力的以番茄和马铃薯为细胞杂交亲本的细胞杂交模型，推动了原生质体融合

31、技术研究的广泛开展。此后、逐步模型，推动了原生质体融合技术研究的广泛开展。此后、逐步形成了通过细胞杂交进行作物改良的新观念形成了通过细胞杂交进行作物改良的新观念。现在学习的是第46页，共78页l 近年来，科学家利用以细胞融合为核心技近年来，科学家利用以细胞融合为核心技术的操作取得了很大的科研成果，杂交育种术的操作取得了很大的科研成果，杂交育种已成为培育动物新品种的一个有效手段。已成为培育动物新品种的一个有效手段。如已培育出如已培育出绵山羊：绵山羊：具有绵羊的卷曲浓密的具有绵羊的卷曲浓密的长毛、山羊式的羊角，毛肉兼用。长毛、山羊式的羊角，毛肉兼用。现在学习的是第47页，共78页l 抗原决定簇：抗

32、原决定簇：存在于抗原分子表面，决定该存在于抗原分子表面，决定该抗原特异性的特殊化学基团。抗原特异性的特殊化学基团。l Polyclonal antibody,PcAbPolyclonal antibody,PcAb：针对多种抗原针对多种抗原决定簇的混合抗体决定簇的混合抗体lMonoclonal antibody,McAb:Monoclonal antibody,McAb:由单个由单个B B细胞克隆细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体现在学习的是第48页，共78页l单克隆抗体的特点单克隆抗体的特点l 1）单克隆抗体是针对单一抗原决定簇的化学结构完全相）单克

33、隆抗体是针对单一抗原决定簇的化学结构完全相同的单一抗体，其特异性强，与其对应抗原的亲和力高度均同的单一抗体，其特异性强，与其对应抗原的亲和力高度均一；一；l 2）杂种瘤细胞株可冷冻于液氮中长期保存，所以）杂种瘤细胞株可冷冻于液氮中长期保存，所以单克隆抗体可以重复、稳定地制备，不会因批号不同单克隆抗体可以重复、稳定地制备，不会因批号不同而产生差异；而产生差异；l 3）产生单克隆抗体的杂交瘤株可在体外扩大培养。）产生单克隆抗体的杂交瘤株可在体外扩大培养。现在学习的是第49页，共78页l 单克隆抗体技术的建立单克隆抗体技术的建立l 1975 1975年英国剑桥大学分子生物学实验室科学家年英国剑桥大学

34、分子生物学实验室科学家KohlerKohler和和MilsteinMilstein将将经经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，首次获得能生产单一抗体的杂交瘤细胞。与血液中的多种抗体首次获得能生产单一抗体的杂交瘤细胞。与血液中的多种抗体比较，该杂交瘤细胞株能持续分泌成分单一、有特异性的抗体，比较，该杂交瘤细胞株能持续分泌成分单一、有特异性的抗体，即单克隆抗体。即单克隆抗体。l 两位科学家也因此而荣获了两位科学家也因此而荣获了19841984年诺贝尔生理学医学奖年诺贝尔生理学医学奖现在学习的是第50页，共78页l包括：包括：l 动

35、物免疫动物免疫l 细胞融合细胞融合l 选择杂交瘤选择杂交瘤l 检测抗体检测抗体l 杂交瘤细胞的克隆化杂交瘤细胞的克隆化l 冻存冻存l 单克隆抗体的大量产生单克隆抗体的大量产生l要经过几个月的一系列实验步骤要经过几个月的一系列实验步骤现在学习的是第51页，共78页l大致步骤如下：大致步骤如下：l 首先取得首先取得抗原抗原，注射到小鼠体内，大约，注射到小鼠体内，大约注射注射4 4次，使小鼠免疫并产生相应的抗体。取次，使小鼠免疫并产生相应的抗体。取小鼠的血清与抗原作用，确定产生抗原小鼠的血清与抗原作用，确定产生抗原-抗体抗体反应。取出免疫小鼠的脾脏制成反应。取出免疫小鼠的脾脏制成脾细胞悬液脾细胞悬液

36、，与与鼠骨髓瘤细胞鼠骨髓瘤细胞混合，加入聚乙二醇形成融合混合，加入聚乙二醇形成融合细胞，又叫杂交瘤。细胞，又叫杂交瘤。现在学习的是第52页，共78页l它具有它具有分泌抗体分泌抗体又能又能迅速生长迅速生长的特性，称为的特性，称为单克隆抗体杂交株。单克隆抗体杂交株。l单克隆抗体大量制备过程：单克隆抗体大量制备过程：细胞融合前的准备细胞融合前的准备 细胞融合与杂交瘤选择细胞融合与杂交瘤选择 抗体的检测与杂交瘤选择抗体的检测与杂交瘤选择 单克隆抗体的大量生产单克隆抗体的大量生产 单克隆抗体的鉴定单克隆抗体的鉴定现在学习的是第53页，共78页l 5.7.1.1 5.7.1.1 细胞融合前的准备细胞融合前

37、的准备 (一一)动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备 一般经过三次免疫过程：初次免疫、第一般经过三次免疫过程：初次免疫、第二次免疫、加强免疫。取加强免疫二次免疫、加强免疫。取加强免疫3 3天后的脾天后的脾脏，制备脾细胞悬液。脏，制备脾细胞悬液。（二）骨髓瘤细胞的获得与培养（二）骨髓瘤细胞的获得与培养 骨髓瘤细胞系应与免疫动物属于同一品骨髓瘤细胞系应与免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于小鼠腹腔内系，这样杂交融合率高，也便于小鼠腹腔内产生大量产生大量McAbMcAb。现在学习的是第54页，共78页l 在准备融合在准备融合两周前开始复苏骨髓瘤细胞两周前开始复苏骨髓

38、瘤细胞，利用一般动物细胞培养液，小牛血清在利用一般动物细胞培养液，小牛血清在10%-10%-20%20%，细胞最大密度不超过，细胞最大密度不超过10106 6/mlml，每每3-53-5天天传代一次。传代一次。现在学习的是第55页，共78页5.7.1.2 5.7.1.2 细胞融合与杂交瘤选择细胞融合与杂交瘤选择 (一一)细胞融合流程细胞融合流程 1 1、取对数生长的骨髓瘤细胞，离心，弃上取对数生长的骨髓瘤细胞，离心，弃上清，用不完全培养基混悬细胞后计数，取所需清，用不完全培养基混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤的细胞数，用不完全培养液洗涤2 2次。次。同时制备同时制备脾细胞悬液

39、脾细胞悬液，用不完全培养液洗，用不完全培养液洗涤涤2 2次。次。现在学习的是第56页，共78页 2 2、将骨髓瘤细胞与脾细胞按将骨髓瘤细胞与脾细胞按1 1：1010或或1 1：5 5的比例混合在一起，用不完全培养液洗的比例混合在一起，用不完全培养液洗涤涤1 1次。离心，弃上清，用滴管吸净残留液次。离心，弃上清，用滴管吸净残留液体。体。3 3、3030s s内加入预热的一定浓度、一定内加入预热的一定浓度、一定分子量的分子量的PEG,(PEG,(聚乙二醇聚乙二醇)，边加边搅拌，边加边搅拌，在室温下融合。加预热的不完全液，终止在室温下融合。加预热的不完全液，终止PEGPEG作用。作用。现在学习的是第

40、57页，共78页 4 4、离心，弃上清，用、离心，弃上清，用2020小牛血清等轻轻混悬，将融合小牛血清等轻轻混悬，将融合后细胞悬液加入后细胞悬液加入9696孔板，孔板，100100ulul孔，孔，3737、5%5%COCO2 2培养箱培养箱培养。培养。（二）二）HATHAT选择杂交瘤选择杂交瘤 一般在融合一般在融合2424h h后，加后，加HATHAT选择培养液选择培养液，在，在HATHAT选择培养选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶缺乏胸苷激酶或次或次黄嘌呤黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞

41、具有上述两种酶，在有上述两种酶，在HATHAT选择培养液可以生长繁殖。选择培养液可以生长繁殖。维持培养两周后，改用维持培养两周后，改用HTHT培养液，再维持培养两周，改用培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。一般培养液。次黄嘌呤胸腺嘧啶核苷氨基喋呤现在学习的是第58页，共78页l5.7.1.3 5.7.1.3 抗体的检测与杂交瘤选择抗体的检测与杂交瘤选择l 筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中仅少数能分泌针对免疫原的杂交细胞系中仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。特异性抗体。检测抗体的方法应根据抗原检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选

42、择不同的筛的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法。选方法。l 一般以快速、简便、特异、敏感的方一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。法为原则。现在学习的是第59页，共78页l常用的方法有：常用的方法有：l 1)1)ELISAELISA用于可溶性抗原用于可溶性抗原(蛋白质蛋白质)、细胞、细胞和病毒等和病毒等McAbMcAb的检测。的检测。l 2)2)RIARIA用于可溶性抗原、细胞用于可溶性抗原、细胞McAb McAb 的检测。的检测。l 3)3)FACSFACS(荧光激活细胞分类仪荧光激活细胞分类仪)用于检查细用于检查细胞表面抗原的胞表面抗原的McAbMcAb检测。检测。l 4)4)I

43、FAIFA（免疫荧光法）（免疫荧光法）用于细胞和病毒用于细胞和病毒McAbMcAb的检测。的检测。现在学习的是第60页，共78页l单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用l1 1）临床诊断及治疗：）临床诊断及治疗：l诊断各类病原体：如乙肝病毒、诊断各类病原体：如乙肝病毒、EBEB病毒等。病毒等。l肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测如肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测如AFPAFP、CEACEA等等l检测淋巴细胞的表面标志如检测淋巴细胞的表面标志如CD3CD3、4 4、8 8等等l“生物导弹生物导弹”以以McAbMcAb作为载体携带某些药物或毒素，将作为载体携带某些药物或毒素，将其携带至靶器官，从而有效

44、地发挥药物作用，直接杀伤其携带至靶器官，从而有效地发挥药物作用，直接杀伤靶细胞。靶细胞。现在学习的是第61页，共78页l单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用l2 2）免疫学研究：免疫学研究：l 签定、区分各种抗原；签定、区分各种抗原；l 检测大分子抗原上不同的抗原决定簇，鉴定各种组织之间的相容性，检测大分子抗原上不同的抗原决定簇，鉴定各种组织之间的相容性，寻找与肿瘤或其他细胞表面抗原结合的优良试剂等；寻找与肿瘤或其他细胞表面抗原结合的优良试剂等；l 对免疫球蛋白基因的定位及表达进行研究工作，分析免疫球蛋对免疫球蛋白基因的定位及表达进行研究工作，分析免疫球蛋白的分子结构，研究免疫球蛋白基因的结构和多

45、样性。白的分子结构，研究免疫球蛋白基因的结构和多样性。l 大分子蛋白的提纯：大分子蛋白的提纯：利用免疫亲和层析的方法提纯的蛋白类大分子杂利用免疫亲和层析的方法提纯的蛋白类大分子杂质低，对产物的起始浓度要求较低。质低，对产物的起始浓度要求较低。现在学习的是第62页，共78页l5.7.1.45.7.1.4单克隆抗体的大量生产单克隆抗体的大量生产l 方法主要有两种：方法主要有两种：l (1)(1)体外使用体外使用旋转培养管旋转培养管大量培养杂交瘤大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。细胞，从上清中获取单克隆抗体。l 此方法产量低、一般培养液含量为此方法产量低、一般培养液含量为10-10-60u

46、g60ugmlml如果大量生产，费用较高。如果大量生产，费用较高。l 现在学习的是第63页，共78页l5.7.1.45.7.1.4单克隆抗体的大量生产单克隆抗体的大量生产l (2)(2)体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清：体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清：l A A、实体瘤法：实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按对数生长期的杂交瘤细胞按1-1-3 3l0l07 7个个mlml接种于小鼠背部皮下接种于小鼠背部皮下、每处注射每处注射0.2ml0.2ml；待肿待肿瘤达到一定大小后瘤达到一定大小后(一般一般10201020天天)则可采血则可采血,从血清中获得从血清中获得单克隆抗体含量可达到单克隆抗体含

47、量可达到1-101-10mg/mlmg/ml。但采血量有限。但采血量有限。现在学习的是第64页，共78页l l B B、腹水的制备腹水的制备：常规是先给小鼠腹腔注射：常规是先给小鼠腹腔注射0.5ml 0.5ml 降植降植烷或液体石腊，烷或液体石腊，1 1-2-2周后腹腔注射周后腹腔注射1 1l0l06 6个杂交瘤细胞，接个杂交瘤细胞，接种细胞种细胞7 7-10-10天后可产生腹水。密切观察动物的健康状况与腹天后可产生腹水。密切观察动物的健康状况与腹水征象、待腹水尽可能多，而小鼠濒临死亡之前，处死小鼠，水征象、待腹水尽可能多，而小鼠濒临死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获

48、用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获110110mlml的腹的腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达克隆抗体含量可达5 5-20mg/ml-20mg/ml，这是目前最常用的方法，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。腹水快、量多。现在学习的是第65页，共78页l 5.7.1.5 5.7.1.5 单克隆抗体的鉴定单克隆抗体的鉴定l对制备的对制备的McAbMcAb进行系统的鉴定是十分必要的。此对其做如下进行系统的鉴定是

49、十分必要的。此对其做如下方面的鉴定：方面的鉴定：l（一）特异性的鉴定（一）特异性的鉴定l（二）（二）McAbMcAb的的IgIg类与亚类的鉴定类与亚类的鉴定l（三（三）McAbMcAb中和活性的鉴定中和活性的鉴定l(四四)McAb)McAb识别抗原表位的鉴定识别抗原表位的鉴定l(五五)McAb)McAb亲和力的鉴定亲和力的鉴定l l 现在学习的是第66页，共78页l5 57 71 16 6 影响因素分析影响因素分析l 出于制备出于制备McAbMcAb的实验周期长，环节多，所以影响因的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。素就比较多，稍不注意就会造成失败。其主要失败原其

50、主要失败原因和影响因素可能有；因和影响因素可能有；l（一）污染一）污染l 包括包括细菌、霉菌和支原体细菌、霉菌和支原体的污染。的污染。一旦发现有霉菌污一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源小牛血清。污染主要来源小牛血清。l 此外，其他添加剂、实验工作人员及环境也可能造成支此外，其他添加剂、实验工作人员及环境也可能造成支原体污染。原体污染。现在学习的是第67页，共78页l5 57 71 16 6 影响因素分析影响因素分析l l 进行支原体检查（对每一批小牛血清和进行支原体检查（对每一批小牛血清和长期