基础医学概论基础医学 (51).pdf

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1、 流式细胞仪原理技术 一、流式细胞仪的基本结构 流式细胞仪的基本结构包括 5 部分：流动室及液流驱动系统；激光光源及光束形成系统；光学系统；信号检测、存储、显示、分析系统；细胞分选纯化系统。1.流动室与液流驱动系统 流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个 430m180m 的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心。这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。流动室内充满了鞘液，鞘液的作用是将样品流环包，鞘液流是一种稳定流动，操作人员无法随意改变其

2、流动的速度。样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。2.激光光源与光束形成系统 目前台式流式细胞仪大多采用氩离子气体激光器。激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。这是由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为 1 微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。激光光束在达到流动室前，先经过透镜聚焦，形成几何尺寸约为 22m66m 即短轴稍大于细胞直径的光斑。这种

3、椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致，须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处。台式流式细胞仪的光路调节对使用者是封闭的，即安装时由工程师调试完毕后，无需使用者作任何调节，所以操作十分方便。激光光束在达到流动室前，先经过透镜聚焦，形成几何尺寸约为 22m66m 即短轴稍大于细胞直径的光斑。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致，须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处。台式流式细胞仪的光路调节对使用者是封闭的，即安装时由工程师调试完毕后，无需使用者作任何调节，所以操作十分方便。图 1 流式细胞仪的流动室与液流驱动

4、系统示意图 3.光学系统 流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。在流式细胞仪的光学系统中主要光学原件是滤光片（filter），主要分成 3 类：长通滤片（LP）、短通滤片（SP）及带通滤片（BP）。4.信号检测、存储、显示、分析系统 当细胞携带荧光素标记物通过激光照射区时，受激光激发，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间 360 度立体角发射，产生散射光和荧光信号。流式细胞仪的光电倍增管（PMT）用来检测散射光和荧光信号，同时将光学信号转换为数字信号。通过计算机和专用软件组成的数据处理系统，对

5、实验数据进行存储、显示和分析。5.细胞分选纯化系统 通过流式细胞仪进行细胞分选的主要目的是对具有某种特征的细胞需进一步培养、研究时进行的。需要用带有分选装置的流式细胞仪才能进行分选工作。当细胞悬液形成液流柱经过流动室，流动室上方的压电晶体产生机械振动带动流动室以相同频率进行振动，使液流柱断裂成一连串均匀的液滴，其形成的速率约每秒钟 3 万个。仅少量液滴含有细胞，同时有大量不含细胞的空白液滴。当实验设计中设计了被分选细胞的特定参数时，此类细胞在形成液滴时会被充电，使其带有正电荷或负电荷，未被设定分选参数的细胞及空白液滴不带电荷。带电荷的液滴在落入电极偏转板的高压静电场后，依所带电荷是正或是负而发

6、生向右或向左偏转，落入指定的收集器中，完成细胞分选的目的。细胞分选的技术指标主要包括分选速度、分选纯度及分选收获率。分选速度指每秒可提取所要细胞的个数。目前台式带分选的仪器的分选速度约为 300 个/秒，大型的流式细胞仪最高分选速度可达每秒上万个细胞。分选纯度指被分选出细胞所占的百分比。一般台式机和大型机的分选纯度均可达到 99%左右。分选收获率指被分出细胞与原来溶液中该细胞的百分比。通常情况下，分选纯度和收获率是互相矛盾的，纯度提高，收获率降低，反之亦然。这是由于样品在液流中并不是等距离一个接着一个有序地排着队，而是随机的。因此，一旦两个不同细胞挨得很近时，在强调纯度和收获率不同条件下，仪器

7、会作出取或舍的决定，因此，选择不同模式要视具体实验要求而定。二、流式细胞术原理 流式细胞仪检测时需将待测细胞制成单细胞悬液，以保证细胞一个一个地通过受检，然后用特异性的荧光探针标记待测细胞。细胞在样品管里稳定地流动，依次经过喷嘴，恒定通过激光束的聚焦光斑区，被功率恒定的激光束激发而产生散射光和激发荧光。这两种信号通过计算机处理后形成数字资料与图像资料。各种图像资料用于显示各个参数之间的相互关系。只有在理解图像资料的基础上，才能对试验结果进行统计分析（图 2）。图 2 流式细胞术原理 1.散射光信号测定 散射光分为前向角散射（FSC）和侧向角散射（SSC）。散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如

8、染色），因此被称为细胞的物理参数或称固有参数。（1）FSC：前向角散射与被测细胞的大小有关，确切说与细胞直径的平方密切相关。FSC 反映了被测细胞的大小，细胞直径越大，FSC 信号越强。通常在 FCM 应用中，选取 FSC 作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。（2）SSC：侧向角散射是指与激光束正交 90方向的散射光信号。侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折均可达到 99%左右。分选收获率指被分出细胞与原来溶液中该细胞的百分比。通常情况下，分选纯度和收获率是互相矛盾的，纯度提高，收获率降低，反之亦然。这是由于样品在液流中并不是等距离一个接着一个有序地排着队，而

9、是随机的。因此，一旦两个不同细胞挨得很近时，在强调纯度和收获率不同条件下，仪器会作出取或舍的决定，因此，选择不同模式要视具体实验要求而定。以上两种信号都是来自激光的原光束，其波长与激光的波长相同，目前采用这两个参数组合，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体（图 3），或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。图 3.外周血白细胞的双参数散点图 2.荧光信号测定 当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号

10、（图 4），通过对这类荧光信号的检测和定量分析，就能了解所研究细胞的参数与定量。图 4 三种荧光素在 488nm 激发光作用下产生不同波长荧光信号 （1）荧光信号的线性测量与对数测量：荧光信号的线性测量与对数测量主要由电子线路来完成。当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管（PMT），PMT 将光信号转换成电信号。有些厂家不采用 PMT，而采用线性放大光电转换器，其优点是降低成本提高线性度，但其最大缺点是响应速度慢，造成仪器分析细胞速度降低，最高速度不可能超过 3300 个细胞/秒。如果样本流速超过此速度会导致数据损失，因此高档仪器

11、不采用此种方法。电信号输入到放大器放大，放大器分线性放大和对数放大两类。线性放大器即放大器的输出与输入是线性关系，细胞 DNA 含量、RNA 含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。但在细胞膜表面抗原等的检测时，通常使用对数放大器，如果原来输出是 1，当输入增大到原来的 10 倍时，输出为 2；当输入增大到原来的 100 倍时，输出为 3 等。在免疫样品中，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍。如用线性放大器，将无法在一张图上清晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来。所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量。一般对 DNA 含量测量时，采用面积（FL2-A），这是因为

12、荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映 DNA 的含量。形状差异较大，而DNA 含量相等的两个细胞，得到的荧光脉冲高度是不等的。经过对荧光信号积分后，所得到的信号值就相等。荧光信号的宽度（如 FL2-W）常用来区分双联体细胞。由于 DNA 样本极易聚集，当两个 G1 期细胞粘连在一起时，其测量到的 DNA 荧光信号（FL2-A）与 G2/M 期细胞相等，这样测量到的 G2/M 期细胞比率会增高，影响测量准确性。通过设“门”（gate）方法，将双联体细胞排除。其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号（FL2-W）要比单个 G2/M 期细胞大，因此设“门”后才能得到真正的 DNA 含量分布曲线和

13、细胞周期。不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可做同样分析。3.荧光补偿形成与调节 当细胞携带两种荧光素（如 PE 和 FITC）受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时，理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到另一种荧光。实际上各荧光素的激发或发射波长是正态或偏态曲线，即有很宽的范围。如下图 5 为 FTIC、PE 的发射波长，可以看到两者的发射波长均为偏态分布，FITC 受激后多数将光源转变为 525nm左右的光；PE 多数将其转变为 575nm 左右的光。图 5.受激光照射后 FITC 和 PE 分子发射光谱互相干扰图 故在流式细胞仪中对 FITC 检测 525nm 附

14、近的光，对 PE 则检测 575nm 左右的光。如果此时同时使用两种荧光染料，就会出现发射光谱相互叠加的现象。根据图 55-4 中 FITC 和PE 发射波长的叠加情况，在流式细胞仪检测光信号时，PE 荧光探测器便会误检由 FITC 发射的 575nm 左右波长的光；此时计算机会将此部分信号计入 PE 荧光信号中，从而引起错误。同样 PE 受激后也会发出小部分 525nm 左右的光，进入 FITC 荧光探测器中。此时就需要进行一系列仪器设置，人为地去除该部分干扰。由于在进行补偿之前的信号都已经过放大电路处理，所以 525nm 或其他波长的光信号可被转化为任何强度的电信号。同时又因为补偿电路在放

15、大电路的后面，故补偿过程中的百分比数值将由两个部分决定：原荧光探测器的信号与漏进其他探测器的信号。补偿最终要达到的效果是：漏进其他探测器的信号-原荧光探测器的信号 xN%=0。由此补偿的百分比数值将随着各荧光探测器的放大倍数（电压）变化而变化。特定电压对应于特定的补偿参数。要确定补偿中百分比数值，需运用以上调节补偿的基本原理并结合特定的标本来实现。正确理解荧光补偿形成与调节是掌握流式细胞术原理的关键内容之一。4.数据显示与分析 流式细胞仪收集细胞产生的各种信号，最终以数字和图形表示。各种图形资料用于显示各个参数之间的相互关系。只有在理解图形资料的基础上，才能对实验结果进行分析和解释。数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。细胞每一个单参数的测量数据可整理成统计分布，以分布直方图（distribution histogram）来显示。而在二维图中，X 坐标为该细胞一参数的相对含量，而 Y 坐标为该细胞另一参数的含量。从双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。设“门”分析（gating analysis）是多参数分析的基础。