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1、精品齐鲁行业资料 欢迎下载 赵鲁宾编辑项目编号 _07012_国家大学生创新性实验计划项目结题表课题名称： 磷酰胆碱基团改性温敏水凝胶 第一作者： 王琼 程冬 所在院系： 高分子科学系 指导教师： 钟伟 导师单位（部门）：复旦大学高分子科学系 填表日期： 2008年3月24日 复旦大学教务处 一、项目信息表项目申请人姓名学号院系专业固定电话手机电子邮件王 琼0444029高分子科学系高分子材料与工程55883954139187203920444029程 冬0444009高分子科学系高分子材料与工程55884691137742504390444009赵翔宇0544122高分子科学系高分子材料与工

2、程65116931135645054790544122唐倩倩0544046高分子科学系高分子材料与工程65119530135855143980544046指导教师钟伟学位/职称副教授研究方向生物材料和医疗器械实验室名称生物医用材料实验室联系人王琼联系方式13918720392研究成果成果形式论文 报告 其他 成果是否发表是 否发表论文题目发表期刊名称期刊类别SCI期刊 EI期刊 ISTP期刊 其他期刊作者排序发表日期卷次、页码二、结题报告磷酰胆碱基团改性温敏水凝胶摘要：通过磷酰胆碱基团化学修饰方法，对聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯（PEO-PPO-PEO）三嵌段共聚物进行了改性。通过测定临界胶束

3、浓度CMC、临界胶束温度CMT以及用流变学方法测定凝胶态模量，结果表明，端基改性对水凝胶的凝胶化过程有着显著的影响，同时改性产物还表现出了较好的pH响应性和生物相容性。关键词：聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物；磷酰胆碱；端基改性1引言水凝胶作为一类新型的合成生物材料，其研究与应用都吸引着广泛的关注。本文所选择研究的PEO-PPO-PEO 嵌段共聚物体系( 商品名为Poloxamer或Pluronic) 即是这样一类凝胶，它们有固态、液态和糊状等各种形态, 相对分子质量从1 000 到14 000，浓缩的Poloxamer 溶液在高温时能够形成可逆凝胶, 当温度降低时又会变成液态, 凝胶

4、温度依赖于聚合物的组成和溶液浓度。该类凝胶, 可用于治疗烧伤和其他的创伤。研究表明，一定临床相关浓度的Poloxamer 118 能够减少红细胞的凝聚和血液粘度, 润滑细胞表面, 减少细胞与细胞间的摩擦1。Pluronic F-127 是一种具有快速可逆凝胶转变行为的非离子表面活性剂, Raymond2 对其作为暂时的栓塞剂进行了研究。把3 mL 22 % Pluronic F-127注射入猎犬的右侧肺叶动脉和右侧肾脏动脉, 形成暂时的闭塞。研究结果表明, 一周内没有出现病理的变异。由于该类水凝胶具有优良的细胞亲和性和可降解性，还可能作为可注射的细胞载体支架，应用于组织工程和组织修复。该类温敏

5、凝胶还被广泛用作可注射的水凝胶药物释放体系,因为水凝胶基质可以使包埋的药物稳定可控地到达体液中,通过把药物包在水凝胶中制成纳米微球、微米微球,然后注射到体内来进行药物的控制释放。也可把大单体和药物一起注入体内,然后经交联形成控释体系3。原位形成的水凝胶可以和组织牢固地结合,有效地控制了水凝胶和药物的释放范围,这样就可以在一个特定的部位形成水凝胶,在病灶处精确地释放包覆的药物。正是由于水凝胶的这些优良的性能，其在药物释放4-6、组织工程7-10等领域都得到了较好的应用并已形成商品化，但它的潜力不仅限于此，在生物材料领域，一种智能药物释放体系正在被呼唤并且吸引了越来越多的研究者。如何开发出具有更好

6、生物相容性的各种可注射的化学刺激响应体系、物理刺激响应体系以及生物信号响应体系、纳米药物释放体系以满足人们在疾病治疗、保健、计划生育及卫生等方面的需求，显然已经成为了水凝胶类生物材料的研究热点。研究表明，对水凝胶三嵌段共聚物体系进行端基化学改性，不仅会影响其微观组装过程，同时也会对其宏观物理性能产生令人惊奇的影响11,12。在本文中，我们合成了一系列用磷酰胆碱基团(COP)进行端基改性的PEO-PPO-PEO 三嵌段共聚物。磷酰胆碱类化合物是天然生物膜中含量最高的一种磷脂化合物，这样改性得到的具有亲水的两性端基和疏水的烷烃分子链的产物的结构同天然生物膜非常相似。同时磷酰胆碱独特的内盐结构和互相

7、间的物理交联效应被预期会给三嵌段共聚物体系带来额外的离子强度或pH等的环境响应性能。为此，我们着重对磷酰胆碱对温敏水凝胶的性能影响作了详细的考察，包括其临界胶束浓度CMC、临界胶束温度CMT的变化以及对pH值的响应性和生物相容性等等。2. 实验部分2.1 原料2.1.1 PEO-PPO-PEO 三嵌段共聚物商品名Pluronic，BASF公司，牌号分别为F-87、F-88、F-108和F127，改性前于40C真空烘箱中干燥过夜。2.1.2 合成2-烷氧基-2-氯代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷（COP）所需原料1. 乙二醇（EG）：分子量62.05；沸点197/760mmHg纯化：用无水硫酸镁干

8、燥24小时后，用金属钠回流，然后减压蒸馏。2三氯化磷（PCl3）：分子量137.33；沸点75.9纯化：回流加热赶出氯化氢气体，约1小时，然后蒸馏，取76馏分3二氯甲烷（CH2Cl2）：分子量84.94；沸点39.8纯化：多次加入少量浓H2SO4，摇匀然后静置，至酸层保持无色。然后加入无氧化二磷粉末，蒸馏并取恒沸点馏分。4苯 ：沸点80.1；nD20：1.5011；纯化：先用浓硫酸浸泡1小时，除去噻吩，然后反复用水洗涤，之后用无氧化二磷回流干燥并蒸馏。2.2 合成2.2.1 COP的合成按照文献13所述方法，如下路线合成COP。+O2 CH2Cl2在一个配有恒压滴液漏斗、回流冷凝管（连有液封管

9、以便与空气隔绝）和磁力搅拌器的三口瓶中，加入一定量的PCl3与干燥CH2Cl2的混合溶液，然后缓慢滴入一定量的干燥EG，滴加的速度控制在HCl气体的生成不至于太剧烈，时间约2.5小时。滴毕，立即换用蒸馏装置，先常压蒸馏除掉溶剂及其部分副产物；当温度升到60时，立即减压蒸馏，得到无色液体CUP。在一个配有回流冷凝管（连液封管以便与空气隔绝）、气体导管和磁力搅拌器的三口瓶中，加入一定量的CUP和干燥苯。在搅拌状态下，缓慢通入干燥的O2。控制温度，使体系微回流。反应20小时后结束，用旋转蒸发仪除掉溶剂，然后减压蒸馏，即得到无色液体,即产物COP。2.2.2 PC-Pluronic的合成 Pluron

10、ic 0.01mol Pluronic F-87或F-88、F-108、 F127和 0.02mol 三乙胺(TEA) 在通氮气环境下混合溶于100mL 干燥THF。在磁力搅拌下，将0.02mol COP 和50mL THF的溶液缓缓滴入，用时3小时。以上操作均在0C下进行。体系继续搅拌2小时，缓慢恢复至室温后，旋蒸除去溶剂，得到中间产物COP-PCL 。随后将COP- Pluronic和40mL三甲胺(TMA)在乙腈中的干燥饱和溶液一起混合。溶液缓缓加热到 65C 并磁力搅拌48 小时. 反应产物被小心加热除去剩余三甲胺，加入到冷的石油醚中沉淀. 重复在THF/石油醚 中的溶解/沉淀过程之后

11、，得到经过磷酰胆碱端基改性的Pluronic (PC-87或PC-88、PC-108 、PC-127)，产物随后于真空烘箱中干燥至衡重。2.3 表征2.3.1 NMR表征对改性前后三嵌段共聚物F108, F127, PC108和 PC127用1H-NMR 谱进行表征，使用仪器Bruker model AVANCE DMX-500，以四甲基硅烷(TMS)为参比，溶剂 (CDCl3) 质子信号为内部标准。2.3.2 GPC表征为进一步表明磷酰胆碱基团被成功引入PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物体系，使用凝胶色谱法(GPC, Agilent 1100 配备3 支PL-gel柱)分别测定F108, F

12、127, PC108 和PC127 的流出时间，THF 流速0.50mL/min-1 ，柱温40 C.2.3.3 CMC及CMT测定CMC测定：配制三嵌段共聚物的系列浓度水溶液，以测量折光率变化转折点的方法测定CMC,对比F-87、PC-87和F-88、PC-88的CMC变化。CMT测定：配制三嵌段共聚物的0.1%wt水溶液，在使用SYP-III玻璃恒温水浴逐渐升温的条件下用DDS-6700型电导率仪测量其电导率变化转折点，对比F-127、PC-127的CMT变化，同时分别测定F127和PC127在pH=3的HCl溶液中的CMT,对比改性前后对pH的响应性。2.3.4 流变学方法测定凝胶态模量

13、使用高级流变扩展系统（ARES）,通过摆动剪切方式，记录样品F-108，F-127,PC-108和PC-127的存储模量(G)和损耗模量(G”),以研究改性前后的聚合物凝胶性质。所有样品均为20%wt水溶液，并在测量之前于4C的环境下存放3天，以便于体系足够分散。采用10rad/s的剪切速率，测量剪切模量随温度的变化，温度从10C逐渐升到60C，升温速率为0.5C每分钟。另外，为研究环境变化如PH对产品性能的影响，同时测量了样品在PH为3的HCl溶液中的剪切模量。2.3.5 生物相容性评价 测试样品F-108、F-127、PC-108和PC-127的部分凝血活酶时间（APTT），凝血酶元时间(

14、PT)和凝血酶时间(TT)来表征其生物相容性。使用仪器sysmex CA-1500，试剂DADE BEHRING Actin, DADE BEHRING Thromburels 和DADE BEHRING Test-Thrombin Reagents。3 结果与讨论3.1 NMR定性表征使用1H NMR 谱来表征PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物的端基，得到如图1所示的谱图，从谱图中可以看到，由于原料三嵌段共聚物的端基是羟基，F-127和F108在2.51ppm处有化学位移。而在改性后的PC-127和PC-108的谱图中，羟基的化学位移峰消失了，取而代之的是三个新的峰（图中a、b、c），PC-

15、127中位于2.57ppm, 3.09ppm 和 4.25ppm处，PC-108中位于2.65ppm, 3.10ppm和4.30ppm处，这些化学位移峰恰好和磷酰胆碱基团上的氢原子相对应，表明磷酰胆碱基团被成功的引入三嵌段共聚物体系。 图1. 三嵌段共聚物NMR表征结果3.2 GPC的定性表征 由图2的GPC表征结果可以明显地看到，改性后的PC-127和PC-108的流出时间,都较之前的F-127和F-108有所提前，表明改性之后，两种嵌段共聚物的分子量都有一定的增加，同时体系的分子量分布并没有明显的差异。GPC的表征结果同样为磷酰胆碱基团的成功引入提供了证据。 图2. 三嵌段共聚物的GPC表

16、征结果3.3 CMC和CMT测定结果 3.3.1 CMC结果使用折光率法测定改性前后三嵌段共聚物的CMC,得到折光率随浓度变化如图3所示。结果显示，改性之后的三嵌段共聚物的CMC都较之前有所减小，从F-87的5.91%w/v变化到PC-87的5.44%w/v,F-88的6.20%w/v到PC-88的5.67%w/v。 图3. 改性前后三嵌段共聚物CMC测定结果(折光率法)表面活性物质在水中形成胶束所需的最低浓度称为临界胶束浓度，以CMC表示。临界胶束浓度可以作为表面活性剂的表面活性的一种量度。因为CMC越小，则表示该表面活性剂形成胶束所需浓度越低，达到表面（界面）饱和吸附的浓度也越低，因而改变

17、表面性质起到润湿、乳化、增溶和起泡等作用所需的浓度也越低14。Pluronic作为一类兼作表面活性剂的水凝胶，形成胶束的能力是其凝胶性能的一个重要体现。CMC的测定结果表明，磷酰胆碱基团端基改性在一定程度上提高了三嵌段共聚物体系形成胶束的能力。3.3.2 CMT结果3.3.2.1 改性前后CMT比较图4. 电导法测定改性前后CMT结果使用电导率法测量F-127和PC-127的CMT,得到图4。由图中可以看到，F-127的CMT原本约为38C，改性后，PC-127的CMT减小为34C。CMT和CMC一样，都是表面活性的重要量度，CMT的结果同样表明端基改性提高了该嵌段共聚物体系形成胶束的能力。据

18、报道，分子特别是像这种热敏性水凝胶中的PPO片段在温度上升到某确定值时会经历一个脱水过程从而形成一个疏水核心的胶束，由于这些球形胶束的紧密堆积，紧接着发生一个溶胶-凝胶转变15,16。在我们目前的研究中，超亲水性的PC基团被修饰到PEO-PPO-PEO嵌段共聚物上，这可能可以促使分子链亲水疏水部分的相分离而提高其形成胶束的能力。3.3.2.2 pH响应性研究 为考察改性体系对pH的响应性，将F-127和PC-127溶于pH=3的HCl溶液中，测量其CMT。从图5可以明显地看到，改性之后的PC-127在有无氢离子存在的情况下CMT有很大的不同，在酸溶液中CMT推后了约9C。而在之前的F127体系

19、中，酸的影响相对微弱的多。这一结果表明，改性后的三嵌段聚合物对pH的响应性被大大提高了，在低pH条件下，其形成胶束的能力大大下降。产生这种现象的主要原因可能是由于磷酰胆碱具有的内盐结构，在体系中完成了充放电的转变过程。 图5. 比较改性前后聚合物在不同pH下CMT变化3.4 流变结果3.4.1 凝胶温敏特性热敏性和浓溶液的可逆性是Pluronic的突出特性，特别是F-108和F-127能显示出更好的凝胶性质，以致可以在相对较低的温度和浓度下形成水凝胶。首先，研究了PC基团修饰对F-108凝胶性能的影响。在图6a中，F-108溶液（浓度20%wt）在大约29开始成为凝胶，凝胶过程进行得很快，在1

20、范围内存储模量从0增加到1000Pa。F-108凝胶在这个测试中表现得像软凝胶，其损耗模量大概比存储模量大两倍。但是同样浓度的PC-108尽管在30左右也出现了凝胶转变，但是它的强度远小于基团修饰前的F-108，并且相比较而言，凝胶过程也非常慢。PC-108的性能表现得也像软凝胶。在F127 和 PC127的测试比较中，也得到了相似的结果（图6b ），改性后凝胶的G 和 G”都有所下降，并且凝胶点延迟，凝胶速度下降。图6b. F-127及PC-127的流变学结果图6a . F-108及PC-108的流变学结果测试结果显示，磷酰胆碱端基改性对三嵌段共聚物的凝胶过程有着显著的影响，使其强度下降，凝

21、胶点延迟。这很可能是因为改性后凝胶的交联密度有所下降的缘故。如CMC与CMT测试结果中所显示的，磷酰胆碱端基改性提高了三嵌段共聚物形成胶束的能力，但是同时由于磷酰胆碱的强亲水性，可能在这些分子的脱水过程而将大量水保留在胶束内，并导致分子不恰当的胶束化。综合CMC与CMT测试与流变结果来看，磷酰胆碱端基改性最终应该是通过影响胶束与胶束间的团聚作用，而破坏了原本由紧密包围的胶束所支持的物理交联结构，因而表现出相对较低的水凝胶强度和可见的更慢的凝胶转变速率。在与F-108和PC-108改性前后变化的比较中，PC基团对F-127的修饰在凝胶转变行为上有相当小的影响，包括水凝胶强度和热敏感性。这可能归因

22、于F-127有更长的PPO片段，因而受到的影响减小。3.4.2 凝胶的pH响应性图7a. F127在水中和在pH=3HCl中流变学结果比较 图7b. PC127在水中和pH=3HCl中流变结果比较 当测量pH=3的环境下的凝胶模量时，F108 的凝胶过程并未发生明显变化。但是当 PC127 溶于pH=3的HCl溶液时，在测试的10 to 60范围内几乎丧失了形成凝胶的能力，和 PC127 溶于水时的表现完全不同。在F108和PC108的测试中也得到了相似的结果。该结果与在pH=3的HCl溶液中测量所得的CMT结果相符，即磷酰胆碱端基改性使三嵌段共聚物在低pH条件下形成胶束的能力下降，进而使其几

23、乎丧失了形成凝胶的能力。磷酰胆碱端基改性给三嵌段共聚物体系带来了额外的pH响应性能，使其成为一种新型的多重响应凝胶。3.5 血液相容性结果早有研究证明，带有磷酰胆碱基团的材料具有很好的抗表面蛋白质吸附和抗血凝性。在先前的研究中，我们发现通过使用上述修饰方法，高分子产品得到了很好的血液相容性。我们将F-108与PC-108，F-107和PC-127的血液相容性分别进行了比较。如图8，F-108和F-127几乎表现出相同的APTT，TT和PT，而PC-108和PC-127则表现出了更好的血液相容性。图8. 改性前后体系的血液相容性比较4. 结论 在成功将磷酰胆碱基团引入PEO-PPO-PEO三嵌段

24、共聚物端基的基础上，这一改性被证明对共聚物的凝胶过程产生了很大的影响，包括凝胶强度减小等。从作用机理上，我们确认了在磷酰胆碱基团改性后，体系CMC和CMT降低，即形成胶束能力增强，故影响凝胶行为的原因主要与阻碍胶束间聚集形成物理胶联结构有关。除此之外，端基改性同时也为三嵌段共聚物带来了额外的pH响应性能及更好的生物相容性，而这一性能则主要是由于磷酰胆碱基团改性后使聚合物在此pH条件下形成胶束能力大大下降而导致的。这种新型的智能凝胶将有望在生物医药、组织工程及药物释放等领域发挥更大的实际应用价值。致谢本论文是在钟伟副教授的精心指导下完成的，非常感谢钟老师在论文选题、实验设计等方面给出的悉心指导。

25、同时，特别感谢孟晟师兄、国璋师兄在实验上的热心指导和帮助，感谢他们帮我们完成流变等我们不能进行的测试。没有你们的帮助，我们就不可能完成这次实验。当然，也感谢组内的同学，特别是两位学弟学妹能够抽出时间，甚至放弃假期来做实验，你们的理解和付出保障了本次课题的圆满结束。另外，衷心感谢系里的老师对我们这个课题的各种建议，让这次实验能够向着我们的方向发展，也谢谢系里为我们提供了方便的实验环境。最后，我还要感谢为我们提供特别帮助的化学系，没有你们的理解和帮助，我们不可能把数据做完整。 参考文献1， 1，Kelly R F. J . Thromb. Thrombolysis , 1998 , 5 : pp2

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27、S., Biodegradable block copolymers for delivery of proteins and water-insoluble drugs. Journal of Controlled Release 2001, 72, (1-3), 203-215.5，Kim, S. W.; Bae, Y. H.; Okano, T., Hydrogels - Swelling, Drug Loading, and Release. Pharmaceutical Research 1992, 9, (3), 283-290.6，Tabata, Y.; Ikada, Y., P

28、rotein release from gelatin matrices. Advanced Drug Delivery Reviews 1998, 31, (3), 287-301.7，Rowley, J. A.; Madlambayan, G.; Mooney, D. J., Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials 1999, 20, (1), 45-53.8，Suh, J. K. F.; Matthew, H. W. T., Application of chitosan-b

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35、，但是通过请教导师或者学长，最终还是把问题解决了。这次科创的意义，不在于我真正做出了什么，因为或许实验结果不能让人满意，而在于它让我学会了如何去做科研，如何一步一步得向着自己的目标走下去。这次事件也让我有了一种想要创新的意识，但是只有意识还是不够的，只有意识付诸于实践，才会结出果实。最后我引用组里杜强国教授的话结束吧：“只要每天做一点，得到一点东西，那么你最后肯定能得到较满意的结果的，只怕你不去做，丢在那里，那样时间就过得很快，一段时间后你会发现你什么都没有。”三、指导老师评语指导教师：年 月 日四、评审意见表课题编号课题名称基本评定课题完成情况：按计划完成，取得预期成果 基本完成，但是与预期目标尚有差距 未达到预期目标成果的创新性：很好 较好一般 没有创新之处成果学术水平：有突破性成果，已发表论文 学术水平较高，成果整理后可发表论文 学术水平尚可，但尚未达到发表论文水平 整个过程符合学术规范，但成果水平一般 不符合学术规范，成果水平较差综合评价与建议结题等级优秀 合格 不合格 评审老师： 年 月 日