载体讲稿.ppt

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1、关于载体第一页，讲稿共五十三页哦2一、噬菌体的一般生物学特性第二页，讲稿共五十三页哦3病毒主要由蛋白质和核酸(DNA或RNA)组成。一类感染细菌的病毒，又称细菌病毒，由此构建的载体称为噬菌体克隆载体。共同特性：个体小、可通过除菌滤器、没有细胞结构、非常专一的寄生性等，非细胞生物。噬菌体(Bacteriophage)第三页，讲稿共五十三页哦4第四页，讲稿共五十三页哦5头膜头膜尾轴尾轴尾鞘尾鞘尾丝尾丝基片基片针针第五页，讲稿共五十三页哦6 溶源性噬菌体 具有溶源生长周期的噬菌体有些噬菌体不在细菌内增殖，其基因整合于细菌基因组中，成为细菌DNA的一部分，当细菌分裂时，噬菌体的基因亦随着分布至两个子代

2、细菌的基因中。整合在细菌DNA上的噬菌体基因称为原(前)噬菌体(Prophage)，带有前噬菌体的细菌称为溶源性细菌(Lysogennic bacteria)。根据噬菌体与宿主细胞的关系烈性（溶菌性）噬菌体温和（溶源性）噬菌体第六页，讲稿共五十三页哦7溶菌性噬菌体溶菌性噬菌体：只具有溶菌生长周期的噬菌体有些病毒感染宿主细胞后，其DNA不插入染色体DNA，经过一定时间的潜伏期，大量增殖新的病毒颗粒，使宿主细胞破裂，释放出来的病毒颗粒又感染其他细胞，也就是将其感染的寄主细胞转变成为噬菌体的“制造厂”产生出大量的子代噬菌体颗粒。第七页，讲稿共五十三页哦8第八页，讲稿共五十三页哦9感染性 快速感染、大

3、量繁殖：1:100。感染4次后可达109 溶菌生命周期溶菌生命周期 吸附 注入/侵入 合成 包装 释放感染性及过程第九页，讲稿共五十三页哦10噬菌体侵染细菌的过程：吸附吸附 首先，噬菌体的尾端吸附在细菌的表面第十页，讲稿共五十三页哦11吸附吸附侵入侵入噬菌体通过尾轴把DNA全部注进细菌体内，而蛋白质外壳则留在细菌体外，不起作用。噬菌体侵染细菌的过程：第十一页，讲稿共五十三页哦12合成合成噬菌体的 DNA 在细菌体内，使细菌本身的 DNA 解体，同时利用细菌的化学成分合成噬菌体自身的 DNA和蛋白质噬菌体侵染细菌的过程：吸附吸附侵入侵入第十二页，讲稿共五十三页哦13组装组装这些新合成的 DNA

4、和蛋白质外壳组装出很多个与亲代一模一样的子代噬菌体。合成合成噬菌体侵染细菌的过程：吸附吸附侵入侵入第十三页，讲稿共五十三页哦14释放释放组装组装合成合成噬菌体侵染细菌的过程：吸附吸附侵入侵入第十四页，讲稿共五十三页哦15二、噬菌体载体由于噬菌体的结构比细菌和高等细胞简单，故广泛用于复制、转录和调节机理的研究。第十五页，讲稿共五十三页哦16噬菌体1.DNA可在体外包装成病毒颗粒，高效地感染大肠杆菌；2.可以把外源DNA插入DNA，引入受体细胞；3.自主复制繁殖性能使外源DNA在受体细胞高效扩增；4.重组DNA的筛选和保存较容易；5.基因转移率较质粒高因噬菌体具有：第十六页，讲稿共五十三页哦17噬

5、菌体理想的克隆载体Bacteriophage :cos sequences circularizea linear genome12-nt12-nt48.5-kbGGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGACGCGGTCGGCCAGCATTGCGTAAC5 GGGCGGCGACCTCGCGGGT-GTTACG 3 3 GCGCCCA-CAATGCCCCGCCGCTGGA 5在在噬菌体线性双链噬菌体线性双链DNA分子分子的两端，各有一条由的两端，各有一条由12个核苷个核苷酸构成的酸构成的5 突出单链突出单链(或称粘端或称粘端)，且两者核苷酸序列互补。当，且两者核苷酸序列互补。当 DNA进入寄

6、主细胞后，粘端进入寄主细胞后，粘端会迅速互补环化形成环状会迅速互补环化形成环状DNA分子。这种由粘端形成的双链分子。这种由粘端形成的双链区称为区称为cos位点位点（cohensive end site,粘性末端位点）粘性末端位点）第十七页，讲稿共五十三页哦18左臂左臂:从从A到到J长约长约20kb，其中，其中的基因编码构成头部、尾部、尾的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质白质中段中段:长约长约20kb,是是DNA整整合和切出合和切出,溶源生长所需的序列溶源生长所需的序列;对溶菌生长是非必需的对溶菌生长是非必需的右臂：长约右臂：长约8kb，是调

7、，是调控区，控制溶菌和溶控区，控制溶菌和溶源生长最重要的调控源生长最重要的调控基因和序列、以及基因和序列、以及DNA复制起始均在这区域复制起始均在这区域内内左右臂包含左右臂包含DNADNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列溶菌生长所需全部序列噬菌体噬菌体DNA全长全长48.5kb第十八页，讲稿共五十三页哦19噬菌体作载体利用噬菌体作载体，主要是将外源DNA替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。删除重复的酶切位点：野生型DNA上，有5个EcoRI位点和7个HindIII，

8、不利于重组操作；在中段非必需区，替换插入某些标志基因如可供蓝白筛选的lacZ序列和多克隆位点等现在广泛使用的噬菌体载体也是作过许多人工改造的，主要的改造是：第十九页，讲稿共五十三页哦主要载体类型免疫功能失活的载体：插入位点位于与免疫相关的基因上，如阻遏基因CI，破坏了阻遏蛋白，不能进入溶源周期。形成有/无免疫反应的两种斑（清亮的裂解噬菌斑和浑浊的溶源斑）-半乳糖苷酶失活插入型载体：lacZ基因表达产物可以使Xgal+IPTG显蓝色。在其基因组中含有一段E.coli的lac5区段，其中编码着-半乳糖苷酶基因lacZ，插入阻断其编码序列，将显为白色。利用单一的酶切位点，可将外源序列插入中段，一般容

9、许插入5-7kb外源DNA。适用cDNA和小片段DNA克隆 插入型载体第二十页，讲稿共五十三页哦21主要载体类型替换型载体替换标记区段（lacZ）或者参与溶源的区段，使有插入的只形成噬菌斑。如Spi+正选择利用成对的酶切位点,可用外源DNA替代中段的一段序列,可替代的片段较大，20kb左右。适用基因组克隆第二十一页，讲稿共五十三页哦22*1.Spi-正选择的原理：野生型的噬菌体不能够在P2噬菌体溶源性的细菌中生长，其表型为Spi+，即对P2噬菌体的抑制作用呈敏感性。这种生长抑制作用是受噬菌体red和gam这两个基因编码产物控制的。如果噬菌体丧失了这两个基因，(例如被外源插入DNA所取代)，这样

10、的噬菌体突变体便获得了Spi-表型，能够在噬菌体P2溶源性的大肠杆菌细胞中生长并形成噬菌斑。因此，具有red和gam基因的替换型载体作克隆实验，可以按照Spi特性来选择重组体。*2.选择标记Spi+表型：不能在P2噬菌体溶源性的E.coli中生长，为非重组体Spi-表型：能够在P2噬菌体溶源性的E.coli中生长，为重组体第二十二页，讲稿共五十三页哦23插入或置换中段外源DNA长度是有一定限制的，当噬菌体DNA长度大于野生型噬菌体基因组105%或小于75%时，包装而成的噬菌体存活力显著下降。按野生型phage MW=48kb计算：包装上限=48105%=51kb 包装下限：48 75%=36k

11、b 而编码必要基因的DNA区段（左臂和右臂）=28kb噬菌体载体理论上可插入大约23kb的外源DNA，这比质粒载体能插入的DNA长得多；而且包装的噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高得多，所以噬菌体载体常用于构建cDNA文库或基因组文库。第二十三页，讲稿共五十三页哦24噬菌体作为载体的优点DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌DNA载体的装载能力为23kb，远远大于质粒的装载量2022/10/1224第二十四页，讲稿共五十三页哦25三、M13单链噬菌体M13是纤维状噬菌体的代表，在结构上与噬菌体有很大不同M13 DNA分子：比噬菌体小得多，环状单链DNA分子，长6407bp，

12、10个基因M13 DNA相对较小的长度意味着它供外源DNA插入的空间要比DNA小很多。第二十五页，讲稿共五十三页哦26第二十六页，讲稿共五十三页哦27可能原因：1.M13的外壳蛋白仅由3种蛋白的多拷贝组装而成，而噬菌体头尾结构包含15种不同蛋白。2.M13侵染周期相对噬菌体简单一些，不需要将基因插入到宿主基因组中。第二十七页，讲稿共五十三页哦28大肠杆菌噬菌体M13是单链环状DNA噬菌体。当侵入寄主后，侵入的单链DNA称为正链DNA。以正链DNA为模板利用寄主细胞的DNA聚合酶复制出与之互补的负链DNA，然后形成双链DNA。在DNA酶的作用下，正链DNA被切断，它的某些内部结构被暴露出来。此时

13、DNA聚合酶以负链DNA为模板，按碱基配对原理，把适当的脱氧核苷酸加至上述被暴露的结构部分。随着复制的进行像一条长尾巴似的被滚出去，所以这种方式叫滚环复制。不断的滚动，复制不断重复，因而新合成的单股长链是一条重复序列，像一个大链条。由核酸内切酶把大链条切成一节一节的线性DNA，每一节都含有相同的碱基序列，最后由DNA连接酶将每一节的首尾相连，形成单链环状DNA。第二十八页，讲稿共五十三页哦29在M13噬菌体基因II和基因IV间有一个长为507bp的基因间区段(intergenic region,IG区段)，该区段含有质粒复制起点，不影响噬菌体的增殖，通过改建形成了M13载体M13噬菌体作载体第

14、二十九页，讲稿共五十三页哦30M13作为克隆载体的吸引力装载能力有限，不超过1kb。以M13为载体克隆基因，能够得到单链形式的DNA。单链形式的克隆基因在一些技术中能够发挥作用，尤其是DNA测序和体外突变。第三十页，讲稿共五十三页哦31单纯以噬菌体为基础构建的载体：装载能力大 转染效率高 操作较难 DNA不稳定单纯以质粒为基础构建的载体：有天然的抗性选择标记 操作容易（易于分离纯化）稳定遗传 装载能力小 转化效率较低第三十一页，讲稿共五十三页哦32三、柯斯质粒载体 cosmid一类用于克隆大片段DNA的载体Cosmid:cos site-carrying plasmid:带有粘性末端位点(co

15、s)的质粒，也叫粘粒一类由人工构建的含有噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体第三十二页，讲稿共五十三页哦33 将DNA左右臂和中段都去除，仅留下两端包装噬菌体所必需的cos序列，再加上质粒的复制序列、标记基因和多克隆位点等，就可构成粘粒载体。载体大小5-7kb，故其克隆能力为45kb左右。外源DNA插入粘粒后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入大肠杆菌，但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的复制方式在细菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于基因组文库的构建。第三十三页，讲稿共五十三页哦34柯斯质粒载体特点1、具有噬菌体的特性：体外包

16、装，高效感染2、具有质粒载体的特性：易于克隆操作、选择和复制扩增3、具有较高容量：最高45kb不能体内包装，不能裂解受体细胞，在细胞内不能形成噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑第三十四页，讲稿共五十三页哦35第三节 高容量载体及其发展方向许多动、植物基因往往含有多个内含子，占据相当长的DNA区域。全基因组序列分析往往需要成百甚至上千kb的DNA片段，而使用普通载体通常难以获得完整的基因序列克隆。人工染色体载体(artificial chromosome vector)：利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。与其他的克隆载体相比，人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达1000kb甚至30

17、00kb的外源DNA片段。第三十五页，讲稿共五十三页哦36YAC载体含有如下元件：酵母染色体的端粒序列酵母染色体的复制子酵母染色体的着丝粒序列酵母系统的选择标记大肠杆菌的复制子/选择标记YAC载体的装载量800-1000kb酵母人工染色体载体（Yeast Artificial Chromosome,YAC）第三十六页，讲稿共五十三页哦37YAC 载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括。自主复制序列自主复制序列(autonomously replication sequences,ARS)一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号着丝粒着丝粒(centr

18、omere,CEN)有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点,使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用,如pYAC4 使用的是酵母第四条染色体的着丝粒端粒重复序列端粒重复序列(telomeric repeat,TEL)定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的 DNA 不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。第三十七页，讲稿共五十三页哦38选择标记选择标记选择标记选择标记-SUP4:-SUP4:-SUP4:-SUP4:SUP4赭石突变抑制基因，抑制赭色表型（成为白色）。不含外源DNA片段的YAC载体转化酵母菌，转化子的菌落成白色。带有插入的外源DN

19、A片段的YAC重组载体，其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。第三十八页，讲稿共五十三页哦39 这种人工染色体载体实际上是一种“穿梭”克隆载体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体(大肠杆菌)质粒复制起始位点(ori)，还含有第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝粒、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。穿梭质粒载体（穿梭质粒载体（shuttle plasmid vectorsshuttle plasmid vectors）：人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体第三十九页，讲稿共五十三页哦40这样的克隆载体在

20、第一受体细胞内可以按质粒复制形式进行高拷贝复制。这种克隆载体在体外与目的DNA片段重组后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素抗性选择标记；而筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补的营养缺陷型。2022/10/1240第四十页，讲稿共五十三页哦41第四十一页，讲稿共五十三页哦42Yeast复制起点E.coli复制起点E.coli选择标记Yeast选择标记MCS大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体大肠杆菌动物细胞穿梭载体常用的穿梭质粒载体第四十二页，讲稿共五十三页哦43穿梭载体的优点 也能利用其它细胞系统（酵母、

21、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。可以自如的在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。克隆、构建表达E.coliAnimal cell 利用大肠杆菌进行基因克隆第四十三页，讲稿共五十三页哦44 由于酵母染色体是线性的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便制备YAC载体，以环状的方式存在。BamHI 酶切位点第四十四页，讲稿共五十三页哦45酵酵母母人人工工染染色色体体构构建建基基因因组组文文库库第四十五页，讲稿共五十三页哦46一些弊端一些弊端:1.在 YAC 载体的插入片段会出现缺失和基因重排2.容易形成嵌合体。即在单个 YAC 中的插入片段由两个或多个独立的基因组片段连接组成。嵌合克隆约

22、占总克隆的 5%50%3.YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小相近，YAC 染色体转入酿酒酵母细胞后很难从中分离出来，不利于进一步分析突出优点突出优点:1.比大肠杆菌对不稳定的、重复的和极端的 DNA 有更强的容忍性2.大型基因组片段可通过 YAC 载体转移到动物或动物细胞系中，进行功能研究(高等真核生物的基因大多数是多外显子结构并且有很长的内含子)第四十六页，讲稿共五十三页哦47 细菌人工染色体Bacterial Artificial Chromosome(BAC)第四十七页，讲稿共五十三页哦48细菌人工染色体是基于大肠杆菌的 F 质粒构建，低拷贝，其装载范围50-300kb之间。大小约7.

23、4kb，本质是质粒克隆载体，与常规克隆载体的核心区别在于复制单元来自F质粒。Bacterial Artificial Chromosome(BAC)第四十八页，讲稿共五十三页哦49正常BAC载体含有：严谨型控制的复制子(oriS)启动DNA复制的解旋酶(RepE)三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座(parA,parB,和parC)标记基因为氯霉素抗性（CmR）Bacterial Artificial Chromosome(BAC)第四十九页，讲稿共五十三页哦50Bacterial Artificial Chromosome(BAC)可以通过互补的原理筛选含有插入片段的重组子 设计了用

24、于回收克隆DNA 的Not酶切位点 用于克隆 DNA 测序的Sp6启动子、T7启动子 第五十页，讲稿共五十三页哦51克隆载体发展历史第一代：质粒，装载小于10 kb片段；第二代：病毒载体，装载能力20 kb左右；第三代：cosmid，装载能力30-45 kb；第四代，YAC，装载能力1-2 Mb；第五代，BAC，MAC等，装载能力50-300 kb第五十一页，讲稿共五十三页哦52掌握克隆载体、穿梭载体、质粒、a-互补、插入失活、人工染色体的概念克隆载体具备的特性蓝白斑筛选原理每种克隆载体装载能力，特点及如何应用第五十二页，讲稿共五十三页哦2022/10/12感谢大家观看第五十三页，讲稿共五十三页哦