第九章基因工程精选PPT.ppt

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1、第九章基因工程第1页，本讲稿共40页第2页，本讲稿共40页第3页，本讲稿共40页第4页，本讲稿共40页转基因植物获得新的性状第5页，本讲稿共40页把大鼠生长因子转入小鼠得到巨大型的转基因小鼠。第6页，本讲稿共40页用噬菌体DNA构建 重组DNA分子第7页，本讲稿共40页用质粒 构建 重组DNA分子第8页，本讲稿共40页n基因重基因重组组(generecombination)是指是指DNA片段在片段在细细胞内、胞内、细细胞胞间间，甚至在不，甚至在不同物种之同物种之间进间进行交行交换换，交，交换换后的片段仍后的片段仍然具有复制和表达的功能。然具有复制和表达的功能。n基因工程基因工程(genetic

2、engineering）是指是指采用人工方法将不同来源的采用人工方法将不同来源的DNA进进行重行重组组，并将重，并将重组组后的后的DNA引入宿主引入宿主细细胞中胞中进进行增殖或表达的行增殖或表达的过过程。程。第9页，本讲稿共40页第10页，本讲稿共40页第11页，本讲稿共40页重重组DNA技技术 n重重组DNA技技术又称又称为基因工程基因工程（geneticengineering）或）或分子克隆分子克隆(molecularcloning)。基因工程的操作基因工程的操作过程主要由以程主要由以下步下步骤组成：成：n载体和目的基因的分离；体和目的基因的分离；n载体和目的基因的切断；体和目的基因的切断

3、；n载体和目的基因的重体和目的基因的重组；n重重组DNA的的转化和化和扩增；增；n重重组DNA的的筛选和和鉴定。定。第12页，本讲稿共40页第13页，本讲稿共40页n n一、一、载体和目的基因的分离体和目的基因的分离n n 为了了进行基因重行基因重组，首先需要，首先需要对载体体DNA和目的基因分和目的基因分别进行分离行分离纯化，得到其化，得到其纯品。品。n（一）（一）载体：体：基因工程中常用的基因工程中常用的载体体(vector)主要包括主要包括质粒粒(plasmid)、噬菌体、噬菌体(phage)和和病毒病毒(virus)三大三大类。这些些载体均体均需需经人工构建，除去致病基因，并人工构建，

4、除去致病基因，并赋予一予一些新的功能，如有利于些新的功能，如有利于进行行筛选的的标志基志基因、因、单一的限制一的限制酶切点等。切点等。第14页，本讲稿共40页n1质粒：粒：是存在于天然是存在于天然细菌体内的一菌体内的一种独立于种独立于细菌染色体之外的菌染色体之外的双双链环状状DNA，具有，具有独立复制独立复制的能力，通常的能力，通常带有有细菌的菌的抗抗药基因基因。最早使用的最早使用的质粒粒DNA是人工构建的是人工构建的pBR322，该质粒分子大粒分子大小小为4.3kb，带有抗四有抗四环素和抗氨素和抗氨苄青霉青霉素基因，含素基因，含EcoR，BamH，Hind等等单一的限制一的限制酶切点。切点。

5、第15页，本讲稿共40页第16页，本讲稿共40页第17页，本讲稿共40页n3病毒病毒：常用的常用的为为SV40，通，通过过感染方感染方式将其式将其DNA送入哺乳送入哺乳动动物物细细胞中胞中进进行增行增殖。目前殖。目前应应用相用相对较对较少。少。第18页，本讲稿共40页n（二）目的基因（二）目的基因：n目的基因的目的基因的筛选筛选和分离可采用以下方法和分离可采用以下方法进进行：行：n1直接从染色体直接从染色体DNA中分离中分离：仅仅适用于适用于原核生物基因的分离，原核生物基因的分离，较较少采用。少采用。第19页，本讲稿共40页n2人工合成：人工合成：n根据已知多根据已知多肽链肽链的氨基酸的氨基酸

6、顺顺序，利用序，利用遗传遗传密密码码表推定其核苷酸表推定其核苷酸顺顺序再序再进进行人工合成。行人工合成。适适应应于于编码编码小分子多小分子多肽肽的基因。的基因。第20页，本讲稿共40页第21页，本讲稿共40页n4从基因文从基因文库库中中筛选筛选：将某一种基因将某一种基因DNA用适当的限制用适当的限制酶酶切断后，与切断后，与载载体体DNA重重组组，再全部，再全部转转化宿主化宿主细细胞，得到胞，得到含全部基因含全部基因组组DNA的种群，称的种群，称为为G文文库库(genomicDNAlibrary)。将某种将某种细细胞的全部胞的全部mRNA通通过过逆逆转转合成合成cDNA，然后然后转转化宿主化宿主

7、细细胞，得到含全部表达胞，得到含全部表达基因的种群，称基因的种群，称为为C-文文库库(cDNAlibrary)。C-文文库库具有具有组织细组织细胞特异性。胞特异性。第22页，本讲稿共40页第23页，本讲稿共40页第24页，本讲稿共40页n n二、二、载体和目的基因的切断体和目的基因的切断n通常采用通常采用限制性核酸内切限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)，简称限制称限制酶，分，分别对载体体DNA和目的基因和目的基因进行切断，以便于重行切断，以便于重组。限制限制酶目前已目前已经发现400多种，所多种，所识别的的顺序往往序往往为4-8个碱基个碱基对，且有，且有回文回文

8、结构构。由限制由限制酶切断后的末端可形成切断后的末端可形成平端、平端、3-突出粘性末端和突出粘性末端和5-突出粘性末端突出粘性末端三种情三种情况。形成粘性末端况。形成粘性末端(cohesiveend)者者较有利于有利于载体体DNA和目的基因的重和目的基因的重组。第25页，本讲稿共40页n n三、三、载体和目的基因的重体和目的基因的重组n n即将即将带有切口的有切口的载体与所体与所获得的目的基因得的目的基因连接起来，得到重新接起来，得到重新组合后的合后的DNA分子。分子。n（一）粘性末端（一）粘性末端连接法接法：当当载体体DNA和和目的基因均用同一种限制目的基因均用同一种限制酶进行切断行切断时，

9、二者即可二者即可带有相同的粘性末端。如将有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端粘性末端进行互行互补粘合，再加入粘合，再加入DNA连接接酶，即可封，即可封闭其缺口，得到重其缺口，得到重组体。体。较少的情况下，少的情况下，对产生的平端也可直生的平端也可直接接进行行连接。接。第26页，本讲稿共40页第27页，本讲稿共40页n（二）人工接尾法（二）人工接尾法：即同聚物加尾即同聚物加尾连连接接法。当法。当载载体和目的基因无法采用同一种体和目的基因无法采用同一种限制限制酶酶进进行切断，无法得到相同得粘性行切断，无法得到相同得粘性末端末端时时，

10、可采用此方法。，可采用此方法。此法首先使用此法首先使用单链单链核酸核酸酶酶将粘性末端切平，再在末端将粘性末端切平，再在末端核苷酸核苷酸转转移移酶酶的催化下，将脱氧核糖核的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于苷酸添加于载载体或目的基因的体或目的基因的3-端，如端，如载载体上添加一段体上添加一段polyG，则则可在目的基可在目的基因上添加一段因上添加一段polyC，故二者即可通，故二者即可通过过碱碱基互基互补进补进行粘合，再由行粘合，再由DNA连连接接酶酶连连接。接。第28页，本讲稿共40页n（三）人工接（三）人工接头连头连接法接法：将人工将人工连连接器接器（即一段含有多种限制（即一段含有多种限制酶酶切

11、点的切点的DNA片片段）段）连连接到接到载载体和目的基因上，即有可体和目的基因上，即有可能使用同一种限制能使用同一种限制酶酶对载对载体和目的基因体和目的基因进进行切断，得到可以互行切断，得到可以互补补的粘性末端。的粘性末端。第29页，本讲稿共40页n n四、重四、重组DNA的的转化和化和扩增增n n 重重组DNA需需导入宿主入宿主细胞才能胞才能进行增殖行增殖或表达。重或表达。重组质粒可通粒可通过转化化（transformation）方式）方式导入宿主入宿主细胞，胞，即将大即将大肠杆菌用杆菌用CaCl2处理，增加理，增加细菌菌细胞壁的通透性，再与重胞壁的通透性，再与重组质粒粒DNA短短暂温育，温

12、育，质粒粒DNA即可即可导入宿主入宿主细胞。胞。第30页，本讲稿共40页n如果是用如果是用噬菌体作噬菌体作为载体的重体的重组体，体，则需要需要用外壳蛋白用外壳蛋白进行包装，使之成行包装，使之成为具有感染能具有感染能力的噬菌体，再通力的噬菌体，再通过转染染(transfection)方式方式将重将重组噬菌体噬菌体DNA导入大入大肠杆菌等宿主杆菌等宿主细胞。胞。重重组DNA导入宿主入宿主细胞后，即可在适当的培胞后，即可在适当的培养条件下养条件下进行培养以行培养以扩增宿主增宿主细胞。胞。对于于质粒粒DNA，还可通可通过在培养基中加入在培养基中加入氯霉素，霉素，抑制抑制细菌蛋白菌蛋白质合成及染色体合成

13、及染色体DNA的复制，的复制，以以单独独扩增增细胞中的胞中的质粒粒DNA。第31页，本讲稿共40页n n五、重五、重组DNA的的筛选和和鉴定定n n由于重由于重组体体导入宿主入宿主细胞的比例通常胞的比例通常较低，低，因此需要因此需要对含有重含有重组体的宿主体的宿主细胞胞进行行筛选并作并作鉴定。可采用以下方法定。可采用以下方法进行：行：n（一）根据重一）根据重组体的表型体的表型进行行筛选：对于于带有抗有抗药基因的基因的质粒重粒重组体，可采用体，可采用插入插入灭活法活法进行行筛选。如。如pBR322中中带有抗氨有抗氨苄青霉素和抗四青霉素和抗四环素基因，当将目的基因素基因，当将目的基因插入抗四插入抗

14、四环素基因后，就可引起素基因后，就可引起该基因失基因失活，活，细菌菌对氨氨苄青霉素耐青霉素耐药，而，而对四四环素素敏感。在含氨敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能青霉素的培养基上能够生生长，而在含四，而在含四环素的培养基上不能生素的培养基上不能生长的的细菌即菌即为带重重组体的体的细菌。菌。第32页，本讲稿共40页第33页，本讲稿共40页n（二）根据（二）根据标标志互志互补进补进行行筛选筛选：当宿主当宿主细细胞存在某种基因及其表达胞存在某种基因及其表达产产物的缺陷物的缺陷时时，可采用此方法，可采用此方法筛选筛选重重组组体。即在体。即在载载体体DNA分子中插入相分子中插入相应应的缺陷基因，如的缺陷基因

15、，如宿主宿主细细胞重新胞重新获获得缺陷基因的表达得缺陷基因的表达产产物，物，则说则说明明该细该细胞中胞中带带有重有重组组体。体。第34页，本讲稿共40页n（三）根据（三）根据DNA限制限制酶酶谱进谱进行分析行分析：经经过过粗粗筛筛后的含重后的含重组组体的体的细细菌，菌，还还需需进进行行限制限制酶酶谱谱分析分析进进一步一步鉴鉴定。将定。将单单一一细细菌菌进进行行扩扩增后分增后分别别提取其提取其DNA，用重，用重组时组时所用的同一限制所用的同一限制酶酶进进行行酶酶切，再将其与切，再将其与不含目的基因的不含目的基因的载载体一起体一起进进行行电电泳比泳比较较分析，如分析，如发现发现出出现现目的基因片段

16、的目的基因片段的电电泳泳带带即即证证明重明重组组体中体中带带有目的基因。有目的基因。第35页，本讲稿共40页第36页，本讲稿共40页n 获获得得带带目的基因的目的基因的细细菌后，可将其菌后，可将其不断不断进进行增殖，从而得到大量的目的基行增殖，从而得到大量的目的基因片段用于分析研究。如在目的基因的因片段用于分析研究。如在目的基因的上游上游带带有启有启动动子子顺顺序，序，则则目的基因目的基因还还可可转录转录表达合成蛋白表达合成蛋白质质。第37页，本讲稿共40页n五、转基因技术五、转基因技术n19821982年年PalmiterPalmiter等等人人首首次次将将大大白白鼠鼠的的生生长长激激素素基

17、基因因放放在在质质粒粒中中小小白白鼠鼠金金属属巯巯基蛋白启动子之后。基蛋白启动子之后。n这这个个启启动动子子通通常常在在染染色色体体上上，控控制制金金属属巯巯基蛋白的转录。基蛋白的转录。n将重组好的这种质粒（几百个拷贝）用将重组好的这种质粒（几百个拷贝）用特制的微量注射器注入小鼠受精卵的特制的微量注射器注入小鼠受精卵的雄性原细胞核（雄性原细胞核（pronucleus）中，再）中，再将这个受精卵植入小鼠将这个受精卵植入小鼠子宫中。第38页，本讲稿共40页 结结果果发发育育生生成成的的小小鼠鼠中中经经SouthenSouthen杂杂交交证证明明许许多多小小鼠鼠中中都都含含有有大大白白鼠鼠的的生生长

18、长激激素素基基因因。而而且且成成熟熟的的小小鼠鼠体体重重比比对对照照大大两两倍倍，成成为为“硕硕鼠鼠”或或“超超级级鼠鼠”。这这个个实实验验首首次次证证明明，外外源源基基因因在在新新的的启启动动子子控控制制下下可可以以整整合合到到哺哺乳乳类类细细胞胞核核内内，并并在在其其中中实实现现有有效效地地表表达达。转转基基因因技技术术中中有有关关外外源源基基因因与与染染色色体体的的定定位位重重组组，表表达达调调控控等等还还有待深入研究。有待深入研究。第39页，本讲稿共40页六、体细胞克隆技术六、体细胞克隆技术n19971997年年 NatureNature杂杂 志志 报报 导导，英英 国国 学学 者者I

19、.Wilmut I.Wilmut 等等人人，从从一一只只胚胚胎胎羊羊中中取取出出乳乳腺腺上上皮皮细细胞胞进进行行培培养养（供供体体），再再用用另另一一母母羊羊的的卵卵细细胞胞（受受体体）摘摘出出细细胞胞核核后后，与与上上述述乳乳腺腺上上皮皮细细胞胞进进行行体体外外融融合合。融融合合体体经经培培养养后后，植植入入受受体体母母羊羊的的子子宫宫中中，结结果果融融合合体体发发育育并并分分娩娩出出一一头头小小羊羊“多多利利”。称称为为克克隆隆羊羊。这这是是2020世世纪纪生生物物科科学学震震惊惊世世界界的的成成就就。它它表表明明成成熟熟的的体体细细胞可以不经过有性繁殖发育成个体。胞可以不经过有性繁殖发育成个体。第40页，本讲稿共40页