第九章基因工程和基因组学精选PPT.ppt

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1、第九章基因工程和基因组学第1页，本讲稿共60页基因工程是一种操作，它不是通过一般传统基因工程是一种操作，它不是通过一般传统的有性杂交方法，而是采取类似于工程建设的的有性杂交方法，而是采取类似于工程建设的方式，按照预先设计的蓝图，借助于实验室的方式，按照预先设计的蓝图，借助于实验室的技术，将某种生物的基因或基因组转移到另一技术，将某种生物的基因或基因组转移到另一种生物中去，使后者定向地获得新的遗传性状，种生物中去，使后者定向地获得新的遗传性状，成为新的类型。成为新的类型。第2页，本讲稿共60页第3页，本讲稿共60页基因工程的施工程序大致分为四个步骤：基因工程的施工程序大致分为四个步骤：1、为施工

2、准备材料，即、为施工准备材料，即“目的目的”基因、载基因、载体和工具酶等。体和工具酶等。2、把目的基因与载体结合成重组、把目的基因与载体结合成重组DNA分子。分子。第4页，本讲稿共60页3、把重组、把重组DNA分子引入受体细胞，分子引入受体细胞，建立分子无性繁系建立分子无性繁系(Clone)或称克隆。或称克隆。4、从细胞群体中选出所需要的无性、从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系，并使外源基因在受体细胞繁殖系，并使外源基因在受体细胞中正确表达。中正确表达。第5页，本讲稿共60页二限制性内切酶二限制性内切酶细菌细胞具有防御异源遗传信息进入的手段。异细菌细胞具有防御异源遗传信息进入的手段。异源源DN

3、A分子进入细菌细胞后，在许多情况下遭到分子进入细菌细胞后，在许多情况下遭到毁灭，这个过程称为限制。限制的能力来源于微生毁灭，这个过程称为限制。限制的能力来源于微生物的一种特殊的酶，称为限制性核酸内切酶。这是物的一种特殊的酶，称为限制性核酸内切酶。这是一种水解一种水解DNA的磷酸二脂酶，它是遗传工程上的的磷酸二脂酶，它是遗传工程上的一种极其重要的工具酶。一种极其重要的工具酶。第6页，本讲稿共60页第7页，本讲稿共60页在酶解时，在酶解时，DNA双链不在同一地方断开，因双链不在同一地方断开，因而产生的片段两端都带有数个碱基的单链尾巴，而产生的片段两端都带有数个碱基的单链尾巴，这两个单链尾巴带有互补

4、的碱基配对顺序，可这两个单链尾巴带有互补的碱基配对顺序，可以互相自动接合成为环状以互相自动接合成为环状DNA，因此称为粘性，因此称为粘性末端。末端。第8页，本讲稿共60页第9页，本讲稿共60页第10页，本讲稿共60页三载体三载体(一一)质粒质粒质粒是在细菌中发现的，它是易于质粒是在细菌中发现的，它是易于取出和引入的小型环状取出和引入的小型环状DNA。一般有。一般有1200Kb左右左右(Kb为千碱基对为千碱基对)它的它的DNA分子分子很小，一般为细菌染色体很小，一般为细菌染色体DNA的的0.53%。第11页，本讲稿共60页第12页，本讲稿共60页噬菌体噬菌体噬菌体基因组全长噬菌体基因组全长49k

5、b,其核酸序列及基因功其核酸序列及基因功能和表达调控已研究得十分清楚。能和表达调控已研究得十分清楚。噬菌体噬菌体DNA中间约三分之二的序列为中间基因簇中间约三分之二的序列为中间基因簇(centralgenecluster)，位于两端的为，位于两端的为DNA左、左、右臂。研究表明，右臂。研究表明，基因组的中间基因簇序列基因组的中间基因簇序列可被外源可被外源DNA片段取代片段取代,而不影响噬菌体感染而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力。细菌及形成噬菌斑的能力。第13页，本讲稿共60页第14页，本讲稿共60页(三三)柯斯质粒柯斯质粒柯柯斯质粒斯质粒(cosmid)是利用部分是利用部分噬菌体噬菌体

6、DNA与部与部分细菌质粒分细菌质粒DNA序列组建而成的序列组建而成的(图图95)。柯。柯斯质粒具有斯质粒具有噬菌体的噬菌体的cos序列序列(12bp)，细菌质，细菌质粒的复制原点。粒的复制原点。第15页，本讲稿共60页第16页，本讲稿共60页(四四)穿梭载体穿梭载体穿穿梭载体梭载体(shuttlevectors)是指能在两种不同的生物中是指能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物复制的载体。例如既能在原核生物(如大肠杆菌如大肠杆菌)中复中复制，又能在真核细胞制，又能在真核细胞(如酵母如酵母)中复制的载体。中复制的载体。第17页，本讲稿共60页第18页，本讲稿共60页(五五)细菌人工染

7、色体细菌人工染色体细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)载体就是为了克隆更大的外源载体就是为了克隆更大的外源DNA片段而设计构片段而设计构建的。建的。BAC载体是基于细菌的性因子载体是基于细菌的性因子(F因子因子)质粒的一些特点构质粒的一些特点构建的。建的。第19页，本讲稿共60页第20页，本讲稿共60页(七七)Ti质粒及其衍生载体质粒及其衍生载体应用基因工程技术改良植物性状时，需要适合于植物的载体系应用基因工程技术改良植物性状时，需要适合于植物的载体系统，才能将重组统，才能将重组DNA运载到植物细胞并使目的基因表达。由运载到植物细胞

8、并使目的基因表达。由Ti质粒衍生的载体，是最早成功地把外源基因导入植物细胞的植质粒衍生的载体，是最早成功地把外源基因导入植物细胞的植物表达载体。物表达载体。第21页，本讲稿共60页第22页，本讲稿共60页四筛选基因库四筛选基因库(一一)从基因库中分离基因从基因库中分离基因基因库基因库(library)是一组是一组DNA和和cDNA序列序列克隆的集合体。克隆的集合体。第23页，本讲稿共60页从基因库中分离基因，首先要构建基从基因库中分离基因，首先要构建基因库。只有利用合乎要求的基因库才有因库。只有利用合乎要求的基因库才有可能筛选出所需要的基因，很多分子遗可能筛选出所需要的基因，很多分子遗传学工作

9、才能继续深入下去。传学工作才能继续深入下去。1.构建基因库构建基因库(1)核基因库核基因库第24页，本讲稿共60页核基因库核基因库(genomiclibrary或或genomicbank)是是将某一生物的全部基因组将某一生物的全部基因组DNA酶切后与载体连接酶切后与载体连接构建而成的。构建而成的。第25页，本讲稿共60页通常的方法是，尽量提取大分子量的通常的方法是，尽量提取大分子量的核核DNA，用限制性酶酶切后，分离选择，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度具有一定长度(大于大于15kb)的的DNA片段，片段，与适宜的载体连接构成重组与适宜的载体连接构成重组DNA分子分子,根根据所用的载体，

10、选择相应的宿主细胞用据所用的载体，选择相应的宿主细胞用于克隆。若载体是质粒，则将连接的重于克隆。若载体是质粒，则将连接的重组组DNA分子转化感受态细胞，收集所有分子转化感受态细胞，收集所有菌落即成为质粒基因库。菌落即成为质粒基因库。第26页，本讲稿共60页(2)染色体基因库染色体基因库将基因组的一部分如一根染色体用来构建基因库，对于选择特异将基因组的一部分如一根染色体用来构建基因库，对于选择特异基因及分析染色体结构和组织十分有价值。例如果蝇基因及分析染色体结构和组织十分有价值。例如果蝇X染色体上染色体上的一个片段，具有的一个片段，具有50多个多线染色体带，利用微切割技术将这一多个多线染色体带，

11、利用微切割技术将这一段染色体切割，抽提段染色体切割，抽提DNA用限制性酶酶切后，克隆到噬菌体上构用限制性酶酶切后，克隆到噬菌体上构建成染色体片段基因库。建成染色体片段基因库。第27页，本讲稿共60页(3)cDNA库库cDNA库是以库是以mRNA为模板，经反转录酶为模板，经反转录酶(reversetranscriptase)合成互补合成互补DNA(complementaryDNA，cDNA)构建的基因库。构建的基因库。第28页，本讲稿共60页第29页，本讲稿共60页第30页，本讲稿共60页2.筛选基因库筛选基因库从基因库中筛选、分离基因，可据对待选基从基因库中筛选、分离基因，可据对待选基因相关信

12、息的了解程度，确定筛选方法和条因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。大多数方法是利用一段核苷酸序列作探件。大多数方法是利用一段核苷酸序列作探针针(probe)，用放射性同位素或非放射性同，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，作探针，筛选基因库位素标记探针，作探针，筛选基因库第31页，本讲稿共60页第32页，本讲稿共60页3.阳性克隆的分析与鉴定阳性克隆的分析与鉴定从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后得到目的基因。得到目的基因。第33页，本讲稿共60页限制性酶图谱限制性酶图谱构建阳性克隆的限制性酶图谱常是分析

13、阳性克隆的第一步。根据同源性构建阳性克隆的限制性酶图谱常是分析阳性克隆的第一步。根据同源性分析，可以了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置，用于进一步亚克分析，可以了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置，用于进一步亚克隆或同已知的其它序列比较。隆或同已知的其它序列比较。第34页，本讲稿共60页图图912表示一个表示一个15kbDNA片段的限制性酶图谱构建方法。片段的限制性酶图谱构建方法。第35页，本讲稿共60页这个方法首先是将这个方法首先是将DNA用限制性酶酶切，然后将酶切的用限制性酶酶切，然后将酶切的DNA进进行琼脂糖凝胶电泳，经过变性处理后，将凝胶上的行琼脂糖凝胶电泳，经过变性处理后，将凝胶上

14、的DNA转移到膜上，转移到膜上，再用经过放射性同位素或非放射性同位素标记的再用经过放射性同位素或非放射性同位素标记的DNA探针与膜上的探针与膜上的DNA片段杂交，洗去膜上非特异性结合的探针后，用片段杂交，洗去膜上非特异性结合的探针后，用X-光片放射自光片放射自显影检测杂交信号显影检测杂交信号核酸分子杂交核酸分子杂交Southern杂交分析杂交分析(Southernblotting)是基因工程中常用的方是基因工程中常用的方法。法。第36页，本讲稿共60页第37页，本讲稿共60页核酸序列测定核酸序列测定只有将克隆后的只有将克隆后的DNA片段进行核酸序列测定后，才能最后确定这个片段进行核酸序列测定后

15、，才能最后确定这个DNA片段的序列是否正确。大多数核酸序列测定采用由片段的序列是否正确。大多数核酸序列测定采用由Sanger于于1977年发明的双脱氧核糖核酸链终止法。年发明的双脱氧核糖核酸链终止法。第38页，本讲稿共60页第39页，本讲稿共60页核酸序列分析核酸序列分析测定的核酸序列是不是所需要的基因，或具有什么功能，还要用计算机软测定的核酸序列是不是所需要的基因，或具有什么功能，还要用计算机软件或生物学实验进一步分析，才能最后得出结论。件或生物学实验进一步分析，才能最后得出结论。第40页，本讲稿共60页(二二)聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)扩增基因扩增基因聚合酶链式反应(polym

16、erasechain)PCR反应包括三个步骤：反应包括三个步骤：1.变性：在变性：在94-95使模板使模板DNA的双链变性成单链。的双链变性成单链。2.复性：两个引物分别与单链复性：两个引物分别与单链DNA互补复性，复性的温度在互补复性，复性的温度在50-70。3.延伸：在引物的引导及延伸：在引物的引导及Taq酶的作用下，于酶的作用下，于72合成模板合成模板DNA的互的互补链。补链。第41页，本讲稿共60页第42页，本讲稿共60页(三三)人工合成基因人工合成基因根根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方

17、法结合起来，可以很快地人工合成基因。的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。第43页，本讲稿共60页第44页，本讲稿共60页第二节基因组学第二节基因组学基因基因组学组学(genomics)是遗传学研究进入分子水平后发展起来的一个分支，主是遗传学研究进入分子水平后发展起来的一个分支，主要研究生物体全基因组要研究生物体全基因组(genome)的分子特征。一个物种的单倍体的染色的分子特征。一个物种的单倍体的染色体数目称为该物种的基因组或染色体组，它包含了该物种自身的所有基体数目称为该物种的基因组或染色体组，它包含了该物种自身的所有基因。因。第45页，本讲稿共60页第46页，本讲稿共60页1、基因组图

18、谱的构建、基因组图谱的构建第47页，本讲稿共60页在进行大规模序列测定之前，构建基因组图谱是测定大基因在进行大规模序列测定之前，构建基因组图谱是测定大基因组全部核苷酸序列的重要一环组全部核苷酸序列的重要一环a、克隆连续序列法、克隆连续序列法(clonecontig)，将基因组，将基因组DNA切割长度为切割长度为0.1Mb-1Mb的大片段，克隆到的大片段，克隆到YAC或或BAC载体上，分别测定单个克载体上，分别测定单个克隆的序列，再装配、连接成连续的隆的序列，再装配、连接成连续的DNA分子。分子。第48页，本讲稿共60页b、定向鸟枪射击法、定向鸟枪射击法(directedshotgun)，以基因

19、组图谱中的标记，以基因组图谱中的标记为依据，测序、装配和构建不同为依据，测序、装配和构建不同DNA片段的序列。片段的序列。第49页，本讲稿共60页(一一)遗传图谱遗传图谱图谱标记图谱标记图谱构建中需要可以鉴别的标记图谱构建中需要可以鉴别的标记(marker)，在构建遗传图谱，在构建遗传图谱中，可用基因和中，可用基因和DNA作为标记。作为标记。第50页，本讲稿共60页 第51页，本讲稿共60页(1)基因标记基因标记基因控制性状的表现，所以也就是利用可以鉴别的形态、生化基因控制性状的表现，所以也就是利用可以鉴别的形态、生化等表型性状作标记等表型性状作标记 第52页，本讲稿共60页(2)DNA标记标

20、记A、限制性内切酶多型性、限制性内切酶多型性B、简单序列长度多型性、简单序列长度多型性a、多次重复序列、多次重复序列(variablenumberoftandemrepeats，VNTRs)，也称为，也称为微随体微随体(minisatellite)。这种重复序列长度为几十个核苷酸。这种重复序列长度为几十个核苷酸。b、简单重复序列、简单重复序列(simpletandemrepeats，STRs)又称为小随体又称为小随体(microsatellite)。第53页，本讲稿共60页C、单核苷酸多型性、单核苷酸多型性单核苷酸多型性单核苷酸多型性(simplenucleotidepolymorphisms

21、，SNPs)是基因是基因中的点突变，存在的数量多，其中有些可产生中的点突变，存在的数量多，其中有些可产生RFLP，但多数突变，但多数突变不是发生在酶切位点。不是发生在酶切位点。第54页，本讲稿共60页遗传图谱的构建遗传图谱的构建(1)人类基因组遗传图谱的构建人类基因组遗传图谱的构建(2)植物基因组遗传图谱的构建植物基因组遗传图谱的构建A、选择亲本、选择亲本第55页，本讲稿共60页B、产生构图群体、产生构图群体第56页，本讲稿共60页C、遗传标记的染色体定位、遗传标记的染色体定位D、标记间的连锁分析、标记间的连锁分析第57页，本讲稿共60页(二二)物理图谱物理图谱基因组物理图谱的构建不需要经过减

22、数分裂的世代群体，可以直基因组物理图谱的构建不需要经过减数分裂的世代群体，可以直接利用接利用DNA分子分析，主要有以下三种不同途径。分子分析，主要有以下三种不同途径。1.限制性酶图谱限制性酶图谱A、用识别较多核苷酸的内切酶、用识别较多核苷酸的内切酶B、选用其酶切位点在基因组中出现频率低的内切酶。、选用其酶切位点在基因组中出现频率低的内切酶。2.荧光原位杂交荧光原位杂交3.序列标签位点序列标签位点第58页，本讲稿共60页(1)特异特异DNA序列序列A、表达的序列标签、表达的序列标签(expressedsequencetag，EST)，表达的序列来自，表达的序列来自cDNA(图图910)，一些，一

23、些cDNA的短片段测序后可作为的短片段测序后可作为EST。B、SSLP也可用于物理图谱的构建。可据遗传图谱中的也可用于物理图谱的构建。可据遗传图谱中的SSLP标记，再标记，再用于物理图谱构建，进而比较和相互验证。用于物理图谱构建，进而比较和相互验证。C、DNA随机片段，可随机选择随机片段，可随机选择DNA片段，测序后经分析比较，如果不是重复片段，测序后经分析比较，如果不是重复序列，也可作为序列，也可作为STS。第59页，本讲稿共60页(2)DNA片段片段利用利用DNA片段作为图谱标记的又可分为两种不同类型，辐射杂交系片段作为图谱标记的又可分为两种不同类型，辐射杂交系及克隆连续序列。及克隆连续序列。A、辐射杂交系、辐射杂交系B、克隆的、克隆的DNA片段序列片段序列第60页，本讲稿共60页