基因克隆载体 (3)讲稿.ppt

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1、关于基因克隆载体关于基因克隆载体(3)第一页，讲稿共三十七页哦第二节第二节 病毒（噬菌体）克隆载体病毒（噬菌体）克隆载体病毒病毒基本结构：基本结构：基本结构：基本结构：DNADNA（或（或RNARNA）+外壳蛋白外壳蛋白外壳蛋白外壳蛋白 噬菌体噬菌体:感染细菌的病毒感染细菌的病毒 分类（根据病毒与宿主的关系）分类（根据病毒与宿主的关系）温和性病毒：温和性病毒：温和性病毒：温和性病毒：溶原性增殖溶原性增殖构建病毒载体构建病毒载体 烈性病毒：烈性病毒：溶菌性增殖溶菌性增殖溶菌性增殖溶菌性增殖改造后改造后改造后改造后 第二页，讲稿共三十七页哦噬菌体的电子显微镜照片一、一、噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体

2、第三页，讲稿共三十七页哦DNA+DNA+外壳蛋白外壳蛋白 1 1、DNA(48.5kb)DNA(48.5kb)噬菌体中：噬菌体中：线性线性 宿主细胞：宿主细胞：环状环状(cos(cos位点位点)（一）（一）噬菌体性质噬菌体性质第四页，讲稿共三十七页哦l l在噬菌体内呈在噬菌体内呈线性双链线性双链DNA分子分子(48502bp)在两在两端各有端各有12个碱基组成的个碱基组成的5单链单链互补粘性末端互补粘性末端(Cohesive end)；l l进入宿主细胞后，粘性末端连接形成环状分子进入宿主细胞后，粘性末端连接形成环状分子(Cos位点位点)。（。（DNA连接酶）连接酶）第五页，讲稿共三十七页哦2

3、 2、噬菌体噬菌体基因组有基基因组有基因因6161个以上个以上J J与与N N、P P与与Q Q之间为之间为非非必需序列必需序列第六页，讲稿共三十七页哦n n迄今已经定位的迄今已经定位的噬菌体基因至少有噬菌体基因至少有6161个，其中个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的调控（有一半左右参与了噬菌体生命周期的调控（必必需基因需基因）；）；n n另一部分基因则被称为另一部分基因则被称为非必需基因非必需基因；当它们被外；当它们被外源基因取代后，不影响噬菌体的生命周期。源基因取代后，不影响噬菌体的生命周期。n n由外源基因取代非必需基因所形成的重组噬菌由外源基因取代非必需基因所形成的重组噬菌体体D

4、NADNA，可以随寄主细胞一起被复制和增殖。，可以随寄主细胞一起被复制和增殖。第七页，讲稿共三十七页哦3 3、限制性核酸内切酶位点限制性核酸内切酶位点:56 56种种4 4、噬菌体的生长途径噬菌体的生长途径 溶菌溶菌生长途径生长途径 溶原溶原生长途径生长途径宿主合成宿主合成int基因产物基因产物-DNA整合到染色体整合到染色体DNA上上 某种胁迫条件下某种胁迫条件下合成合成six基因产物基因产物-DNA脱离细菌染色体脱离细菌染色体溶菌溶菌第八页，讲稿共三十七页哦（二）构建依据（二）构建依据 1 1、噬菌体是一种温和噬菌体噬菌体是一种温和噬菌体 2 2、能承载较大的外源、能承载较大的外源DNAD

5、NA片段片段 野生型野生型DNADNA头部可包装约头部可包装约36.436.451kb51kb(自身的自身的75%75%105%)105%)，且约有，且约有20kb20kb DNA DNA可缺失（生长可缺失（生长非必需）非必需）3 3、在、在DNADNA上有多种限制性内切酶位点上有多种限制性内切酶位点 第九页，讲稿共三十七页哦（三）构建的基本策略与技术路线（三）构建的基本策略与技术路线 策略策略:n n切去部分非必需区切去部分非必需区n n删掉多余的限制性内切酶位点删掉多余的限制性内切酶位点n n插入选择性标记基因插入选择性标记基因n n建立体外包装系统建立体外包装系统第十页，讲稿共三十七页哦

6、n n技术路线技术路线 1 1 1 1、用限制性酶切去非必需区，抹去多余识别位点、用限制性酶切去非必需区，抹去多余识别位点 选定一种酶，以选定一种酶，以选定一种酶，以选定一种酶，以gtWES gtWES 为例，为例，为例，为例，EcoRIEcoRI（48.5kb48.5kb48.5kb48.5kb）DNA DNA E co R I E co R I E co R I E co R I 6 6个片段个片段 第十一页，讲稿共三十七页哦uuB B B B片段是片段是片段是片段是噬菌体生长非必需的；噬菌体生长非必需的；噬菌体生长非必需的；噬菌体生长非必需的；uuC C C C片段缺失可阻断溶原生长途径

7、，但不影响溶菌途径；片段缺失可阻断溶原生长途径，但不影响溶菌途径；片段缺失可阻断溶原生长途径，但不影响溶菌途径；片段缺失可阻断溶原生长途径，但不影响溶菌途径；uuE E E E片段去掉片段去掉片段去掉片段去掉min5min5min5min5序列（序列（序列（序列（2.6kb2.6kb2.6kb2.6kb）。）。）。）。两端两端两端两端EcoR IEcoR IEcoR IEcoR I别点经点突变或甲基别点经点突变或甲基别点经点突变或甲基别点经点突变或甲基化处理，即得化处理，即得化处理，即得化处理，即得gtWESgtWESgtWESgtWES：（：（：（：（48.5-5.5-2.6=40.4kb4

8、8.5-5.5-2.6=40.4kb48.5-5.5-2.6=40.4kb48.5-5.5-2.6=40.4kb）克隆能力：克隆能力：克隆能力：克隆能力：替换替换替换替换B B B B：最大：最大：最大：最大：51-(40.4-4.9)=15.5kb 51-(40.4-4.9)=15.5kb 51-(40.4-4.9)=15.5kb 51-(40.4-4.9)=15.5kb 最小：最小：最小：最小：36.4-(40.4-4.9)=0.9kb 36.4-(40.4-4.9)=0.9kb 36.4-(40.4-4.9)=0.9kb 36.4-(40.4-4.9)=0.9kb 实际应用时克隆能力略有

9、出入（实际应用时克隆能力略有出入（实际应用时克隆能力略有出入（实际应用时克隆能力略有出入（p109,p109,p109,p109,表表表表3-53-53-53-5）4.9kb21.6kb5.5kb7.5kb5.9kb3.3kb第十二页，讲稿共三十七页哦 2 2、在、在DNADNA的非必需区内插入选择标记基因的非必需区内插入选择标记基因（1 1）自然筛选）自然筛选（51kb51kb51kb51kb或或36.4kb36.4kb36.4kb36.4kb不能包装）不能包装）（2 2 2 2）插入选择标记基因）插入选择标记基因 取代取代redred和和gamgam基因基因野生型野生型野生型野生型噬菌体噬

10、菌体噬菌体噬菌体(Spi+(Spi+(Spi+(Spi+表型表型表型表型)在在在在P2P2P2P2噬菌体溶原性细胞中噬菌体溶原性细胞中噬菌体溶原性细胞中噬菌体溶原性细胞中不能不能不能不能生长生长生长生长 （redredredred、gamgamgamgam基因基因基因基因）外源外源外源外源DNADNADNADNA取代取代取代取代 获获获获Spi-Spi-Spi-Spi-表型表型表型表型 在在在在P2P2P2P2噬菌体溶原性细胞中噬菌体溶原性细胞中噬菌体溶原性细胞中噬菌体溶原性细胞中能能能能生长生长生长生长 redredredred、gamgamgamgam基因基因基因基因 局限性：局限性：局限

11、性：局限性：只能以只能以只能以只能以P2P2噬菌体溶原细胞作为受体噬菌体溶原细胞作为受体 最常用的筛选标记：最常用的筛选标记：Lac ZLac Z基因基因第十三页，讲稿共三十七页哦3 3、建立重组、建立重组、建立重组、建立重组DNADNA分子体外包装系统分子体外包装系统体外重组体外重组DNADNADNADNA分子必须经分子必须经体外包装体外包装成噬菌体颗粒后，成噬菌体颗粒后，成噬菌体颗粒后，成噬菌体颗粒后，才能转导受体细胞。才能转导受体细胞。才能转导受体细胞。才能转导受体细胞。野生型野生型野生型野生型噬菌体感染的细胞中无多余的外壳蛋白。噬菌体感染的细胞中无多余的外壳蛋白。D D-（D D基因缺

12、失噬菌体）基因缺失噬菌体）基因缺失噬菌体）基因缺失噬菌体）受体细胞受体细胞积累除积累除D D D D蛋白以蛋白以蛋白以蛋白以外所有蛋白质外所有蛋白质外所有蛋白质外所有蛋白质E E E E-（E E E E基因缺失噬菌体）基因缺失噬菌体）基因缺失噬菌体）基因缺失噬菌体）受体细胞受体细胞受体细胞受体细胞积累除积累除积累除积累除E E E E蛋白以蛋白以外所有蛋白质外所有蛋白质混合混合 D D、E E互补互补互补互补 包装包装包装包装DNADNA分子分子分子分子 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体 如如如如:菌株菌株BHB2688(EBHB2688(EBHB2688(EBHB2688(E-)+BHB2690(

13、D)+BHB2690(D-)第十四页，讲稿共三十七页哦第十五页，讲稿共三十七页哦（四）（四）噬菌体克隆载体的应用噬菌体克隆载体的应用 1 1、建立、建立c DNAc DNA基因文库基因文库 n n转导转导(transduction)(transduction)由噬菌体和细胞病毒介导由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程。的遗传信息转移过程。效率高效率高。n n转染转染(transfection)(transfection)指真核细胞主动或者被动指真核细胞主动或者被动导入外源导入外源DNA DNA 片段而获得新表型的过程。片段而获得新表型的过程。2 2、克隆外源目的基因、克隆外源目的基因第十六

14、页，讲稿共三十七页哦（五）重组（五）重组DNADNA分子的体外包装（自分子的体外包装（自学）学）1 1、溶原菌、溶原菌BHB2688(EBHB2688(E-)和和BHB2690(DBHB2690(D-)的检验的检验2 2、制备包装物、制备包装物3 3、体外包装、体外包装第十七页，讲稿共三十七页哦（一）构建策略（一）构建策略（一）构建策略（一）构建策略 由由由由质粒质粒质粒质粒和和和和含含含含coscoscoscos位点位点位点位点的的的的DNADNADNADNA片段片段片段片段组装成的载体，即组装成的载体，即组装成的载体，即组装成的载体，即cosmidcosmidcosmidcosmid克隆载

15、体克隆载体克隆载体克隆载体,又叫粘粒又叫粘粒又叫粘粒又叫粘粒;或：或：或：或：cosmidcosmidcosmidcosmid克隆载体是一类带有克隆载体是一类带有克隆载体是一类带有克隆载体是一类带有噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNADNADNA粘性末端顺序的质粘性末端顺序的质粘性末端顺序的质粘性末端顺序的质粒粒粒粒DNADNADNADNA分子。是分子。是分子。是分子。是噬菌体质粒噬菌体质粒噬菌体质粒噬菌体质粒混合物。混合物。混合物。混合物。二、二、cosmidcosmid克隆载体（柯斯质粒载体）克隆载体（柯斯质粒载体）第十八页，讲稿共三十七页哦（二）（二）cosmidcosmid的特征的特征

16、 1 1、环形双链、环形双链DNADNA分子分子分子分子,36.4kb,36.4kb,一般一般10kb10kb 2 2 2 2、具有质粒的性质，可转化大肠杆菌，并按质粒方式复、具有质粒的性质，可转化大肠杆菌，并按质粒方式复制制 3 3、含有一个、含有一个coscoscoscos位点位点 A A A A蛋白蛋白蛋白蛋白 coscos末端末端末端末端体外包装成为噬菌体，体外包装成为噬菌体，体外包装成为噬菌体，体外包装成为噬菌体，但不含但不含但不含但不含噬菌体溶菌生长途径、溶原生长途径和噬菌体溶菌生长途径、溶原生长途径和DNADNA复复复复制系统，不会产生子代噬菌体制系统，不会产生子代噬菌体制系统，

17、不会产生子代噬菌体制系统，不会产生子代噬菌体第十九页，讲稿共三十七页哦4 4 4 4、cosmidcosmid较小，可承载更大的外源较小，可承载更大的外源较小，可承载更大的外源较小，可承载更大的外源DNA DNA 若若cosmidcosmid为为为为6.5kb6.5kb，则可承载，则可承载44.5(51-6.5)kb44.5(51-6.5)kb外源外源外源外源DNADNADNADNA，且能被包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。，且能被包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。，且能被包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。，且能被包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。因此，因此，因此，因此，cosmidcosmid克隆广

18、泛用于构建基因组文库。克隆广泛用于构建基因组文库。第二十页，讲稿共三十七页哦（三）柯斯克隆（三）柯斯克隆(Cosmid cloning)(Cosmid cloning)(1)(1)定义定义 应用柯斯质粒作载体，在大肠杆菌寄主细胞应用柯斯质粒作载体，在大肠杆菌寄主细胞中克隆大片段的真核基因组中克隆大片段的真核基因组DNADNA的技术，叫做柯的技术，叫做柯斯克隆。斯克隆。这个定义的三个要点是：这个定义的三个要点是：a.a.柯斯质粒作载体；柯斯质粒作载体；b.b.大肠杆菌为寄主大肠杆菌为寄主;c.c.克隆大片段的真核基因组克隆大片段的真核基因组DNADNA。第二十一页，讲稿共三十七页哦（2 2）理论

19、依据）理论依据a.a.a.a.在在在在 phagephagephagephage线性线性线性线性DNADNA分子的每一端都具有彼此互补的单分子的每一端都具有彼此互补的单链突出序列，即所谓的链突出序列，即所谓的粘性末端粘性末端(cos(cos位点位点位点位点)b.b.b.b.phagephage的的的的多连体分子多连体分子是由是由coscos连接而成的。连接而成的。cos cos cos cos cos coscos cos cos cos cos coscos cos cos cos cos coscos cos cos cos cos cosc.c.c.c.末端酶末端酶(treminase)

20、(treminase)或叫或叫TerTer体系体系体系体系即即即即 phagephagephagephage具有一具有一种位点特异的切割体系种位点特异的切割体系(site-specific cutting(site-specific cutting(site-specific cutting(site-specific cutting system).system).system).system).A A A A蛋白蛋白蛋白蛋白*此系统能识别两个相距适宜的此系统能识别两个相距适宜的(36.436.436.436.451kb51kb51kb51kb)cos)cos位点，位点，并切割之。并切割之。

21、*根据上述分析可知根据上述分析可知根据上述分析可知根据上述分析可知 phage DNAphage DNAphage DNAphage DNA包装的两个必要条件是：包装的两个必要条件是：coscos位点、位点、TerTerTerTer体系（体系（体系（体系（A A A A蛋白）蛋白）第二十二页，讲稿共三十七页哦（3 3）柯斯质粒包装条件）柯斯质粒包装条件 由于只有在被作用的由于只有在被作用的由于只有在被作用的由于只有在被作用的 DNADNA分子具有两个分子具有两个coscoscoscos位点，位点，而且它们之间距离保持在而且它们之间距离保持在36.436.451kb51kb51kb51kb的条件

22、下，的条件下，TerTer体系才能对它发生作用。体系才能对它发生作用。据此推断：据此推断：据此推断：据此推断：柯斯质粒是不能作为包装体系的，因为它只有一个柯斯质粒是不能作为包装体系的，因为它只有一个柯斯质粒是不能作为包装体系的，因为它只有一个柯斯质粒是不能作为包装体系的，因为它只有一个coscoscoscos位点。位点。因此：柯斯质粒只有在同适当大小的外源因此：柯斯质粒只有在同适当大小的外源因此：柯斯质粒只有在同适当大小的外源因此：柯斯质粒只有在同适当大小的外源DNADNADNADNA片段重组成具片段重组成具有有两个两个两个两个coscos位点位点而且相距达而且相距达36.436.451kb5

23、1kb之间时，才能被之间时，才能被之间时，才能被之间时，才能被包装。包装。包装。包装。第二十三页，讲稿共三十七页哦 利用利用Cos质粒进行克隆质粒进行克隆 第二十四页，讲稿共三十七页哦（四）使用（四）使用（四）使用（四）使用cosmidcosmidcosmidcosmid载体的基本程序载体的基本程序载体的基本程序载体的基本程序 利用利用cosmidcosmid的的质粒质粒性质，可按质粒操作转化受体细胞性质，可按质粒操作转化受体细胞 利用利用利用利用cosmidcosmid的的噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体性质性质转导受体细胞（下图）转导受体细胞（下图）第二十五页，讲稿共三十七页哦三、三、三、三、M1

24、3M13M13M13噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体（单链丝状噬菌体载体（单链丝状噬菌体载体 ）第二十六页，讲稿共三十七页哦含复制起始位点含复制起始位点及可插入外源及可插入外源DNADNA的位点的位点（一）（一）（一）（一）M13 DNA M13 DNA M13 DNA M13 DNA 环状单环状单环状单环状单链链链链DNADNADNADNA分子（分子（分子（分子（“+”+”+”+”链链链链DNADNADNADNA）大小：大小：大小：大小：6.4kb 6.4kb 6.4kb 6.4kb 结构：结构：结构：结构：10101010个区个区个区个区 基因间隔区（基因间隔区（基因间隔区（基因间隔区（ISI

25、SISIS区）区）区）区）第二十七页，讲稿共三十七页哦（二）（二）M13DNAM13DNAM13DNAM13DNA复制和复制和M13M13M13M13噬菌体增殖噬菌体增殖 M13 DNA“+M13 DNA“+M13 DNA“+M13 DNA“+”链进入链进入链进入链进入雄性大肠杆菌雄性大肠杆菌雄性大肠杆菌雄性大肠杆菌 合成合成合成合成“-”-”-”-”链链链链产生产生产生产生双链双链双链双链M13 DNAM13 DNAM13 DNAM13 DNA（复制型（复制型（复制型（复制型DNADNADNADNA或或或或RF-DNARF-DNARF-DNARF-DNA）按环状双链按环状双链按环状双链按环状

26、双链DNADNADNADNA方式复制，同时以方式复制，同时以方式复制，同时以方式复制，同时以“+”+”+”+”链链链链DNADNADNADNA为模板转译包装蛋为模板转译包装蛋为模板转译包装蛋为模板转译包装蛋白白白白 RF-DNARF-DNARF-DNARF-DNA达达达达200200200200拷贝时，单链拷贝时，单链拷贝时，单链拷贝时，单链DNADNADNADNA特异结合蛋白与特异结合蛋白与特异结合蛋白与特异结合蛋白与“+”+”+”+”链结合而阻链结合而阻链结合而阻链结合而阻断合成断合成断合成断合成“-”-”-”-”链链链链 结果只能以结果只能以结果只能以结果只能以“-”-”-”-”链为模板

27、合成链为模板合成链为模板合成链为模板合成“+”+”+”+”链链链链 “+”+”+”+”链链链链DNADNADNADNA被包装蛋白包装成新的被包装蛋白包装成新的被包装蛋白包装成新的被包装蛋白包装成新的M13M13M13M13噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体 挤出受体细胞挤出受体细胞挤出受体细胞挤出受体细胞 受体细胞不被溶菌。受体细胞不被溶菌。受体细胞不被溶菌。受体细胞不被溶菌。第二十八页，讲稿共三十七页哦第二十九页，讲稿共三十七页哦第三十页，讲稿共三十七页哦M13 DNAM13 DNA复制特征：复制特征：复制特征：复制特征：以双链以双链DNADNA为中间媒介为中间媒介 培养物培养物培养物培养物高速离心高

28、速离心高速离心高速离心上清中含噬菌体颗粒上清中含噬菌体颗粒上清中含噬菌体颗粒上清中含噬菌体颗粒“+”+”链链DNA DNA 沉淀菌体沉淀菌体破碎后，可提取破碎后，可提取RF-DNARF-DNA 第三十一页，讲稿共三十七页哦（三）（三）M13M13噬菌体克隆载体的构建策略和途径噬菌体克隆载体的构建策略和途径 策略：策略：在在RF-DNARF-DNA的的ISIS区插入选择标记基因，并组装合适区插入选择标记基因，并组装合适区插入选择标记基因，并组装合适区插入选择标记基因，并组装合适 RF-DNARF-DNARF-DNARF-DNA上有上有上有上有1010个个BsuIBsuIBsuIBsuI位点位点位

29、点位点部分酶切部分酶切获得全长线形获得全长线形RF-DNA,RF-DNA,与含与含与含与含LacZLacZLacZLacZ标记的标记的标记的标记的HindHindHindHind酶切片段进行平末端连酶切片段进行平末端连接接M13mp1M13mp1M13mp1M13mp1载体载体。为获得合适的克隆位点。为获得合适的克隆位点,可在可在Lac ZLac ZLac ZLac Z区区区区插入连杆插入连杆插入连杆插入连杆 构建构建成对成对成对成对M13M13M13M13载体载体载体载体，保证外源，保证外源DNADNADNADNA两条链都能随两条链都能随两条链都能随两条链都能随“+”链一起复制包装。链一起复

30、制包装。链一起复制包装。链一起复制包装。第三十二页，讲稿共三十七页哦HindBHH第三十三页，讲稿共三十七页哦（四）（四）M13M13克隆载体的优点与应用克隆载体的优点与应用 优点：优点：优点：优点：1 1 1 1、以、以、以、以双链环形双链环形双链环形双链环形DNADNADNADNA为中间媒介复制，可与为中间媒介复制，可与为中间媒介复制，可与为中间媒介复制，可与质粒质粒质粒质粒一样体外纯化操作一样体外纯化操作一样体外纯化操作一样体外纯化操作 2 2 2 2、制备的、制备的、制备的、制备的M13 DNAM13 DNAM13 DNAM13 DNA单、双链单、双链单、双链单、双链都能转化大肠杆菌，

31、直接转染受体细胞都能转化大肠杆菌，直接转染受体细胞都能转化大肠杆菌，直接转染受体细胞都能转化大肠杆菌，直接转染受体细胞 3 3 3 3、单链、单链、单链、单链DNADNADNADNA不受包装限制，可包装不受包装限制，可包装不受包装限制，可包装不受包装限制，可包装M13 DNAM13 DNAM13 DNAM13 DNA分子分子分子分子6 6 6 6倍的倍的倍的倍的DNADNADNADNA分子分子分子分子 4 4 4 4、可产生大量纯化的含外源、可产生大量纯化的含外源、可产生大量纯化的含外源、可产生大量纯化的含外源DNADNADNADNA插入的单链插入的单链插入的单链插入的单链DNADNADNADNA分子分子分子分子 主要用途：主要用途：主要用途：主要用途：克隆、分离单链外源克隆、分离单链外源克隆、分离单链外源克隆、分离单链外源DNADNADNADNA片段片段片段片段 获得的获得的获得的获得的“+”+”+”+”链可直接用于链可直接用于链可直接用于链可直接用于DNADNADNADNA测序测序测序测序第三十四页，讲稿共三十七页哦MCS连杆连杆第三十五页，讲稿共三十七页哦第三十六页，讲稿共三十七页哦感谢大家观看第三十七页，讲稿共三十七页哦